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AntonioSillo
Nuovo Arrivato
61 Messaggi |
 Inserito il - 27 giugno 2014 : 15:55:31
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Ciao a tutti,
ho fatto diversi saggi EMSA su degli estratti citosolici e nucleari.
Ogni campione è stato incubato con poly dI/dC per ridurre le interazioni tra il probe di DNA da testare e le proteine che legano in maniera specifica il DNA.
Vedo lo shift del complesso DNA-Proteina, c'è una scomparsa dello shift quando metto l'anticorpo che riconosce la proteina(come immunogeno ha il full length della proteina), ma quando metto il competitor freddo di DNA sia 100x che 500x lo shift non sparisce.
Come mai?
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
 Inserito il - 28 giugno 2014 : 12:59:10
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 Scritto da MolecularLab Mobile
Come realizzi il saggio? Quanto dura l'incubazione e come prepari le mix? |
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AntonioSillo
Nuovo Arrivato
61 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2014 : 14:37:39
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| Il saggio viene realizzato preparando la mix di reazione con il binding buffer 1x, l'edita per chetare eventuali metalli bivalenti estranei a quelli che voglio testare, glicerolo per aumentare la densità della miscela e diminuire il moto di correlazione delle molecole, cloruro di magnesio per stabilizzare il mio double strand, poly ddi dc per ridurre le interazioni specifiche, poi h20. dopo aver posto eguali quantità di mix nelle eppendorf verso stessa quantità di estratto proteico, poi a seconda dei casi incubo per 10 minuti col metallo da testare, poi aggiungo il compatito ove necessario e subito dopo il probe biotinilato. la reazione di binding ha una durata complessiva di 30 minuti. poi carico su gel di poliacrilammide |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 01 luglio 2014 : 19:15:29
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Scritto da MolecularLab Mobile
Che oligonucleotide usi come competitore freddo? Ha esattamente la stessa sequenza della hot-probe? È più lungo? Più corto? |
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AntonioSillo
Nuovo Arrivato
61 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2014 : 07:23:44
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| è esattamente lo stesso ma non biotinilato;) |
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