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Pizzo_edi
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 Inserito il - 03 luglio 2014 : 16:02:51
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Salve a tutti!
Ho un piccolo problema derivante da una mutazione sito specifica e in parallelo con l'inserzione di una sequenza codificante un peptide nel mio clonaggio.
Essendo più precisi, questi sono i vettori che ho al momento
- ER-KeimaRed-E2A in pSCB (in pratica c'è la sequenza di ritenzione nell'ER, una proteina fluorescente e un peptide self cleaving)
Il problema con questo plasmide è che una volta ottenuto il sequenziamento presenta una mutazione puntiforme.
Abbiamo quindi disegnato gli oligo per una mutazione puntiforme per pcr.
La PCR non da assolutamente problemi, così come la libagione (corsi entrambi su gel, bande al corretto posto e presenza di DNA)
Il problema è che la trasformazione non funziona, non riesco ad ottenere colonie.
- il secondo plasmide presenta gli stessi problemi, solamente che in questo caso sto cercando di inserire dopo la cassetta NLS-GFP un'altro peptide self cleaving.
Disegnati gli oligo per inserirli, PCR e ligazione funzionano ma non ottengo colonie
le cellule competenti che ho provato ad usare sono le DH5-alpha e le Top10 della invitrogen... sempre stesso risultato, no colonie!
Qualcuno ha una qualche idea del perché non funzioni?
Grazie mille in anticipo!
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Mutagenesi sito diretta e inserzione di peptide
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