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Giuliavgn
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1 Messaggi

Inserito il - 15 ottobre 2014 : 09:37:31  Mostra Profilo Invia a Giuliavgn un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, avrei bisogno di un consiglio su una real-time PCR semi quantitativa.
Sto cercando di analizzare l’espressione di 4 geni in cellule follicolari ed oociti murini coltivati in condizioni diverse. I campioni sono molto piccoli (10 oociti, per fare un esempio) quindi lavoro con quantità ridotte di RNA e cDNA. Ho iniziato l’analisi dei primi 3 geni e in ogni caso, indipendentemente dai primers, dalle condizioni di amplificazione e dal tipo di cellule, quando visualizzo le curve di melting ho 2 prodotti di amplificazione: il mio prodotto specifico e un mini picco di un aspecifico con una temperatura di melting di 5 gradi più alta. Il picco è sempre bassissimo ed è sempre lo stesso in ogni caso.

Non è contaminazione di genomico, non è contaminazione dei reagenti perché sono stati cambiati tutti e, comunque, i bianchi sono sempre puliti. Avete un’idea di cosa possa essere? Purtroppo non è possibile escluderlo dalla quantificazione perché il prodotto che quantifico è la somma di specifico+aspecifico. Ho provato a cambiare le condizioni di amplificazione rendendole il più stringenti possibili, ma quel picchetto infido rimane.

Ringrazio INFINITAMENTE in anticipo chiunque possa darmi qualche consiglio!!


Giulia

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 15 ottobre 2014 : 23:16:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
in ogni caso, indipendentemente dai primers, dalle condizioni di amplificazione e dal tipo di cellule, quando visualizzo le curve di melting ho 2 prodotti di amplificazione: il mio prodotto specifico e un mini picco di un aspecifico con una temperatura di melting di 5 gradi più alta.

Il mini picco è sempre 5 gradi sopra il picco principale? Ma i picchi principali hanno tutti la stessa melting?
Se la melting cambia non è lo stesso aspecifico
Citazione:
Il picco è sempre bassissimo ed è sempre lo stesso in ogni caso.

Puoi mettere un'immagine della melting?
Se corri su un gel il prodotto della PCR vedi 2 amplificati?

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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