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 problemi di digestione GST-YFP
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darknihal
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Inserito il - 16 ottobre 2014 : 14:04:28  Mostra Profilo Invia a darknihal un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti. Premetto che sono una tesista quindi mi scuso in anticipo se non riuscirò a spiegarmi al meglio. Sto lavorando con una YFP ricombinante nella quale ho agiunto 8 arginine a monte della proteina (il mio scopo è farla entrare nelle cellule e dalla letteratura ho visto che questo tag funziona). la struttura finale della proteina nel lisato batterico è GST-R8-YFP. Ho purificato la proteina con una resina di GSH agaroso usando un equilibrio a pH 8 ed eluendola a pH 8.5 (non posso scendere di pH perchè la proteina precipita, PI=7.25, inoltre a 7.5 si attacca così forte che non riesco a staccarla). la proteina riesco a purificarla in questo modo, ma ho problemi con la digestione. l'enzima che dovrebbe separare GST da r8-YFP è la prescission, la quale ha un range di pH di azione tra 7 e 8 e ho necessità che questa digestione avvenga sennò con il GST la proteina non entra nella cellula (credo perchè sia troppo grossa). ora.. ho provato la digestione su colonna a pH 7 e precipita sulla resina, ho provato a pH pù alto e rimane comunque in resina. ho provato a far avvenire la digestione in soluzione invece che su resina a pH 7.6 e 7.8 e non va, non digerisce nulla.. per caso qualcuno di voi ha qualche altra idea?

darknihal
Nuovo Arrivato



3 Messaggi

Inserito il - 16 ottobre 2014 : 17:45:46  Mostra Profilo Invia a darknihal un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
dimenticavo.. il tampone nella quale agisce la prescission è
50 mM tris (pH variabile, ne ho provati un po')
0,15 M NaCl
1 mM EDTA
1 mM DTT
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