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sharon1991
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2 Messaggi

Inserito il - 20 novembre 2014 : 15:42:30  Mostra Profilo Invia a sharon1991 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti
Vorrei chiedervi un aiuto per capire meglio l'alpha complementazione.
Ho capito che se prendiamo un mutante di E. coli che esprime solo il frammento omega e lo cloniamo con un vettore che esprime il frammento alpha, per alpha complementazione la beta-galattosidasi (avendo bisogno dei due domini per funzionare) potrÓ esprimere le sue funzionalitÓ ed idrolizzare lattosio e simili(ad esempio X-gal). La mia domanda Ŕ: se il sito di policlonaggio del plasmide pUC si trova proprio nel frammento alpha e se cloniamo quest'ultimo con un frammento omega viene meno l'integritÓ funzionale dell'enzima come faccio a fare alpha-completamentazione???

midichloria
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75 Messaggi

Inserito il - 21 novembre 2014 : 11:17:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di midichloria Invia a midichloria un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il sito di policlonaggio Ú inserito all'interno di pUC proprio per questo motivo. Se tu inserisci una sequenza di tuo interesse, il frammento alpha non Ú pi˙ prodotto e otterrai colonie bianche invece che blu. In questo modo puoi identificare rapidamente le colonie trasformate da quelle che non contengono il tuo inserto.

Comunque non ho capito molto bene l'ultima frase. Per fare l'alpha complementazione non Ú necessario che i due frammenti della b-galattosidasi siano vicini. Alla fine il tuo interesse non Ú di per se "esprimere la b-galattosidasi", ma solo sfruttarla per verificare l'inserzione di un frammento di tuo interesse.
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sharon1991
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2 Messaggi

Inserito il - 21 novembre 2014 : 15:05:51  Mostra Profilo Invia a sharon1991 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scritto da MolecularLab Mobile

Grazie mille!!!sei stato chiarissimo e di grande aiuto =)
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