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fatalerror
Nuovo Arrivato
Città: bruxelles
20 Messaggi |
 Inserito il - 08 marzo 2007 : 12:31:03
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Ciao a tutti,
devo fare 1 esperimento di acetilazione IN VITRO, le HAT le ho acquistate, ma la mia proteina d'interesse non ce l'ho, ho solo un vettore d'espressione eucariote che non è GST. Ho pensato di transfettare la proteina nelle 293T, immunoprecipitarla e fare l'esperimento di acetilazione direttamente sulle biglie.Il problema è che devo poter sapere la quantità di proteina che metto nella reazione. Farò due immunoprecipitazioni identiche, una servirà per dosare le proteine e l'altra per fare l'acetilazione. Il problema è come dosare??????il laemli DTT reagisce con le soluzioni per dosare le proteine: c'è troppo sds e dtt, e se diluisco troppo le mie prot ho paura che non saranno + abbastanza contrate per dosarle! Qualcuno conosce un modo per staccare le proteine dalle biglie in modo che possa dosarle? Inoltre un altro problema riguarda gli anticorpi...una volta messo un laemli dtt o una soluzione a effetto simile, anche gli anticorpi saranno in sospensione e quindi li doserò con le proteine d'interesse e visto che ci sono dei mg di anticorpi, anche facendo un "bianco" con un tubo dove ho messo giusto il tampone di IP, le biglie e gli anticorpi, anche una piccola differenza di presenza di anticorpi da un tubo all'altro potrà coprire la vera differenza in proteine, che saranno presenti in concentrazione molto più debole nel mio eppendorf rispetto agli anticorpi.
Spero di essere stata chiara...e spero che potrete aiutarmi
grazie
miriam
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tommasomoro
Utente Junior
358 Messaggi |
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fatalerror
Nuovo Arrivato
Città: bruxelles
20 Messaggi |
Inserito il - 08 marzo 2007 : 15:31:47
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In realtà non si tratta di un dosaggio dell'attività acetyltransferasi, io devo giusto vedere se la mia proteina X è acetilabile, ma nella mia reazione devo mettere 500ng della proteina X con 2microg di HAT e una certa quantità di [3H
]acetyl-CoA, quindi vorrei avere 1 idea di quanta proteina X ho sulle biglie per mettere una quantità +/- proporzionale di HAT e di acetyl-CoA..xò misa che non c'è verso perchè ho chiesto a un sacco di persone e nessuno sa darmi una risposta esaustiva...bisognerebbe clonare la sequenza della proteina X in un vettore GST...ma purtroppo ci abbiamo già provato per diversi mesi e non ci siamo riusciti..
pensi che non ci sia modo di stimare la quantità di prot che ho sulle biglie dati i problemi che ho spiegato sopra?
grazie ancora
miriam |
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tommasomoro
Utente Junior
358 Messaggi |
Inserito il - 08 marzo 2007 : 18:33:07
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prova metodo spannometrico
fai un gel e invece di colorarlo con il comassie
che comunque credo abbia un limit of detection di circa 10 20ng
(fonte google) lo colori con silver staining o similari
sempre che la tua proteina non comigri assieme alle bande degli IgG
e ci metti di fianco delle quantita' note di una proteina di
concentrazione nota
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 08 marzo 2007 : 18:55:38
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attenta che in silver staining classico proteine diverse possono colorarsi + o meno intensamente anche in maniera indipendente dalla quantità!
Se non ricordo male si dovrebbe fare prima un passaggio di comassie colloidale per rendere il silver staining quantitativo, ma forse ricordo male e sto sparando una cazz... |
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tommasomoro
Utente Junior
358 Messaggi |
Inserito il - 08 marzo 2007 : 23:51:37
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boh non lo so !
ma se la differenza fra
igg ed immunoprecipitato e' molta mi sa
chi viene un pastrocchio sul gel colorato
bisogna pensare qualcosa di diverso
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fatalerror
Nuovo Arrivato
Città: bruxelles
20 Messaggi |
Inserito il - 09 marzo 2007 : 19:21:53
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Per le IgGs non ci sarebbe problema perché migrano +o- a 50 e la mia proteina migra +o- a 87. Quindi potrei provare con la colorazione in argento, ma non so se sarà facile estimare la concentrazione cosi'.
A forza di leggere dappertutto avevo trovato un metodo di dosaggio di proteine che, secondo l'autore, non avrebbe dovuto reagire con sds e B-mercaptoetanolo: si tratta del metodo dell'acido nitrico (lettura a 358 nm). Allora oggi ho cercato una ricetta di laemmli con il B-mercaptoetanolo al posto del dtt e non mi sono + preoccupata del SDS. Ho messo 2microL soltanto...il risultato è che anche questo metodo è incompatibile con il laemmli... |
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Black Mamba
Nuovo Arrivato
Città: Roma
24 Messaggi |
Inserito il - 26 marzo 2007 : 22:17:18
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 GUARDA IO CI LAVORO CON L ACETILAZIONE
ESISTE UN KIT APPOSITO IN COMMERCIO!!! |
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tommasomoro
Utente Junior
358 Messaggi |
Inserito il - 26 marzo 2007 : 22:37:36
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GUARDA IO CI LAVORO CON L ACETILAZIONE
ESISTE UN KIT APPOSITO IN COMMERCIO!!!
ed e' dato di sapere anche a noi poveri ignoranti???
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Black Mamba
Nuovo Arrivato
Città: Roma
24 Messaggi |
Inserito il - 28 marzo 2007 : 17:13:27
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| CONTROLLO A LB LA CASA KE LO PRODUCE!!! |
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dosaggio proteine immunoprecipitate
Didattica
