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Vale_roma_iss
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2 Messaggi

Inserito il - 21 luglio 2015 : 18:19:35  Mostra Profilo Invia a Vale_roma_iss un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
salve,
sono mesi che cerco di ottimizzare il protocollo per visualizzare tramite immunofluorescenza l'istone H2AX. Per motivi tecnici semino le cellule (mesenchimali staminali umane) nelle slide flask della NUNC. Il protocollo prevede i seguenti passaggi
PFA 2% raffreddata a +4°C, 10 min su ghiaccio
3 lavaggi con PBS +4°C. 5 minuti su ghiaccio
Permeabilizzazione con Metanolo (pre-raffreddato a –20°C), 5 minuti su ghiaccio
3 lavaggi con PBS +4°C. 5 minuti su ghiaccio
Bloccaggio con BSA al 5% per 1h a T ambiente
Anticorpo primario dil 1:400 in PB (permeabilization buffer: PBS + 2% BSA. 2h a 37°C in camera umida.
3 lavaggi con PBS + Tween20 allo 0.05% . 5 minuti in agitazione
Anticorpo secondario dil 1:500 in PB (permeabilization buffer: PBS + 2% BSA). 1h a T ambiente al buio.
4 lavaggi con PBS + Tween20 allo 0.05% . 10 minuti in agitazione
Montaggio campioni con Vectashield Mounting Medium con DAPI

Ho provato anche a tenere la BSA a +4°C o.n. ma in tutti i casi ho una fluorescenza verde diffusa sopra i nuclei piu' o meno puntinata. Credo che sia un legame aspecifico ma non so come uscirne.....
Qualcuno sa darmi una mano????
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