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Tag   RIP    RT-PCR  Aggiungi Tag

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alytes
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3 Messaggi

Inserito il - 06 gennaio 2016 : 01:44:32  Mostra Profilo Invia a alytes un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti,
devo fare una RIP per verificare se un fattore di splicing si lega a un determinato RNA target. Ho letto diversi protocolli, ma non mi è chiaro qual è il criterio di scelta dei primers da utilizzare nello step di RT-PCR: posso posizionarli in un punto qualsiasi dell'RNA? è meglio metterli in prossimità degli esoni regolati? il mio dubbio nasce dal fatto che non so se durante la procedura di immunoprecipitazione l'RNA possa venire frammentato (in questo caso solo i tratti di messaggero protetti dal legame con il fattore di trascrizione resterebbero intatti e "amplificabili"). Magari è una preoccupazione eccessiva... c'è qualcuno che può chiarirmi il dubbio?grazie
antonella

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 21 gennaio 2016 : 22:37:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Quando ho fatto io la RIP ho disegnato 4 coppie di primer diverse in 4 punti diversi dell'RNA target, perchè non sapevo quale funzionasse...e infatti 3 su 4 hanno amplificato...
Ti consiglio di fare lo stesso...

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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alytes
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3 Messaggi

Inserito il - 22 gennaio 2016 : 12:01:35  Mostra Profilo Invia a alytes un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok, quindi posso metterli dove voglio! grazie mille :D
posso chiederti anche quale protocollo di RIP hai seguito?
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 24 gennaio 2016 : 13:25:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io l'ho fatto in Hela trasfettate con la mia proteina flaggata, stimolato per indurre il binding della mia proteina all'mRNA da studiare e...

...and then lysed in Triton X-100 lysis buffer containing RNasin 1 U/ml. After an additional 15 min on ice, cell extracts were centrifuged for 10 min at 14,000 g at 4 #778;C, and supernatants were incubated with anti-FLAG Abs bound to agarose beads (M2, Sigma-Aldrich) for 3 h at 4 #778;C. Immunoprecipitates were washed five times with Triton X-100 lysis buffer containing RNasin U/ml. RNA was extracted by using TRIzol (Invitrogen) reagent according to the manufacturer’s instructions. Immunoprecipitated RNA was reverse transcribed by using the GoScript reverse transcriptase (Promega). PCR was carried out with cDNAs by Expand High Fidelity PCR System (Roche). To amplify the mRNA region Experimental PCR conditions were 95 #778;C for 30 s, 60 #778;C for 30 s, and 68 #778;C for 1 min (40 cycles). The PCR products were analyzed by 1% agarose gel electrophoresis.

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
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alytes
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3 Messaggi

Inserito il - 24 gennaio 2016 : 16:55:07  Mostra Profilo Invia a alytes un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ti ringrazio moltissimo
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