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mika
Nuovo Arrivato

Prov.: Como
Città: como


2 Messaggi

Inserito il - 24 marzo 2007 : 09:36:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mika Invia a mika un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti,
ho un problema con un western blot: usando un certo Ab vedo solo bande aspecifiche, ma dopo 2stripping e 2 incubazioni con 2diversi Ab (proteine ad altezze diverse), sembra che le bande della proteina iniziale siano comparse (l'altezza è proprio quella e quasi sicuramente non sono aspecifici degli altri 2 anticorpi). Può essere?! Il laboratorio che ci ha fornito il primo Ab dice che anche loro hanno problemi: infatti perchè si vedano le bande, prima guardano la proteina housekeeping, poi fanno lo stripping e quindi incubano con l'Ab di interesse, mentre se usano direttamente il primo Ab sulla membrana "nuova", le bande non si vedono. A qualcuno è mai successo niente di simile e ha una spiegazione/un consiglio?
Grazie!
Mika[

Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 24 marzo 2007 : 15:37:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Cambia anticorpo!

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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Biochica
Utente Junior




285 Messaggi

Inserito il - 24 marzo 2007 : 21:05:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Biochica Invia a Biochica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Anch'io opterei per il cambio di anticorpo...

Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit-
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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 24 marzo 2007 : 21:18:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ma avete provato a contattare il referente per la ditta che produce questi anticorpi? è molto strano...
in ogni caso ti consiglio di leggere bene il datasheet e concordo sul cambio di anticorpo

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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mika
Nuovo Arrivato

Prov.: Como
Città: como


2 Messaggi

Inserito il - 25 marzo 2007 : 13:54:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mika Invia a mika un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In realtà l'anticorpo è stato fatto da un altro laboratorio del nostro istituto.loro lo usano su linee celulari umane (funziona se usato dopo uno stripping), noi su colture primarie di ratto, ma la proteina è quasi uguale. Abbiamo provato due anticorpi commerciali (e non ce ne sono molti altri contro la fratassina), ma non si vede nulla, seguendo i datasheets pari pari!! sarà un problema di lisi? boh!
mika
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Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 25 marzo 2007 : 17:41:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
un problema di lisi dici? non credo, almeno da quel che mi ricordo io la fratassina dovrebbe avere localizzazione citosolica, quindi è una proteina abbastanza facile da estrarre. ma lavorate su lisati semplici o su immunoprecipitati?
comunque, ho provato a dare uno sguardo sul pubmed e mi sono usciti parecchi lavori sulla fratassina, magari potresti provare a vedere che tipo di buffer di lisi hanno usato.

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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