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 clonazioni in ceppi dam+/dcm+
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Teobromina
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27 Messaggi

Inserito il - 27 gennaio 2016 : 14:59:06  Mostra Profilo Invia a Teobromina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti..avrei dei dubbi per quanto riguarda il clonaggio in coli di un dato inserto.. allora praticamente, ho l'inserto a cui devo legare i linker che mi permetteranno l'aggancio al vettore dopo averlo trattato con un oppurtuno enzima di restrizione.. per far si che l'enzima di restrizione crei delle estremitÓ compatibili senza tagliare l'inserto, tratto prima l'inserto con una metilasi oppurtuna (quindi caratteristica per l'enzima di restrizione che devo usare). A questo punto agisco con l'enzima di restrizione, ed effettuo la ligazione.. ma se devo inserire il plasmide in coli, con i sistemi dam e dcm attivi..per impedire che l'inserto non venga degradato si dovrebbe far in modo che le metilazioni che ho fatto in precedenza siano compatibili con quelle che i sistemi dam e dcm riconoscono come self, giusto? quindi queste metilazioni come vengono fatte? forse prima metilo in modo da permettere la ligazione col vettore, poi questo vettore lo clono in un sistema dam-/dcm- in modo che la metilazione venga persa e il pattern acquisito mi permetta di clonarlo finalmente in un sistema dam+/dcm+?
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