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Bio90
Nuovo Arrivato

Città: Milano


2 Messaggi

Inserito il - 18 febbraio 2016 : 19:07:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Bio90 Invia a Bio90 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti,
Spero in qualche modo possiate aiutarmi.
Per qualche motivo ho problemi con l'estrazione di rna da tessuti di pesce.
Ho campionato e messo i tessuti in esame in rnaLater.
Dopo di che messi a -80°C.
Le prime estrazioni venivano bene senza problemi. Dopo a causa di problemi tecnici non ho più estratto e i campioni sono rimasti molti mesi circa 10 a -80°C.
Ora vado per estrarre con classico metodo, utilizzando quiazol o trifast (stessa roba), aggiungendo cloroformio centrifugando, recuperando la fase acquosa e precipitando con isopropanolo e via così.
Finisco l'estrazione e vado a quantificare con nanodrop e mi da un valore di rna presente molto alto, anche 2000ug/ul, con un valore A260/280 perfetto intorno a 2 e il valore 260/230 circa 0,6. Essendo sporchi, da probabile fenolo, provo a precipitare l'rna di nuovo usando acetato di sodio e etanolo per mezz'ora a -80°C.
Centrifugo, elimino il resto e faccio seccare il pellet e risospendo in acqua rnasi free, alla lettura mi da un valore molto più basso di rna circa 200ug/ul (anche meno 97ug/ul) con un valore 260/230 minore a quello prima circa 0,4.
Ora il problema non è il nanodrop ho provato a verificare con rna già quantificati e mi da i risultati già annotati.
Ho provato anche il kit quiagen rnamini plus con un altro buffer di lisi ma non estrae poco o niente e sempre con valori 260/230 molto bassi. I campioni estratti prima dei 10 mesi di giacenza erano comunque sporchi ma meno e dopo precipitazione i rapporti erano perfetti.
L'unico problema che posso pensare è che i campioni non siano più così freschi e che l'rna sia degradato in qualche modo o che possa esserci stato un guasto al -80°.
Mi sono dimenticato di precisare, uso materiale rnasi free e puntali con filtro.
Non so che pensare, spero che mi darete consigli utili grazie :)

SpaziO InfinitO
Nuovo Arrivato

Prov.: TO
Città: Torino


47 Messaggi

Inserito il - 10 aprile 2016 : 15:05:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpaziO InfinitO Invia a SpaziO InfinitO un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Bio90

Ciao a tutti,
Spero in qualche modo possiate aiutarmi.
Per qualche motivo ho problemi con l'estrazione di rna da tessuti di pesce.
Ho campionato e messo i tessuti in esame in rnaLater.
Dopo di che messi a -80°C.
Le prime estrazioni venivano bene senza problemi. Dopo a causa di problemi tecnici non ho più estratto e i campioni sono rimasti molti mesi circa 10 a -80°C.
Ora vado per estrarre con classico metodo, utilizzando quiazol o trifast (stessa roba), aggiungendo cloroformio centrifugando, recuperando la fase acquosa e precipitando con isopropanolo e via così.
Finisco l'estrazione e vado a quantificare con nanodrop e mi da un valore di rna presente molto alto, anche 2000ug/ul, con un valore A260/280 perfetto intorno a 2 e il valore 260/230 circa 0,6. Essendo sporchi, da probabile fenolo, provo a precipitare l'rna di nuovo usando acetato di sodio e etanolo per mezz'ora a -80°C.
Centrifugo, elimino il resto e faccio seccare il pellet e risospendo in acqua rnasi free, alla lettura mi da un valore molto più basso di rna circa 200ug/ul (anche meno 97ug/ul) con un valore 260/230 minore a quello prima circa 0,4.
Ora il problema non è il nanodrop ho provato a verificare con rna già quantificati e mi da i risultati già annotati.
Ho provato anche il kit quiagen rnamini plus con un altro buffer di lisi ma non estrae poco o niente e sempre con valori 260/230 molto bassi. I campioni estratti prima dei 10 mesi di giacenza erano comunque sporchi ma meno e dopo precipitazione i rapporti erano perfetti.
L'unico problema che posso pensare è che i campioni non siano più così freschi e che l'rna sia degradato in qualche modo o che possa esserci stato un guasto al -80°.
Mi sono dimenticato di precisare, uso materiale rnasi free e puntali con filtro.
Non so che pensare, spero che mi darete consigli utili grazie :)





Ciao! Secondo me il problema sta proprio nel procedimento. Fai bene ad usare puntali con filtro e materiali RNA free (sarebbe sbagliatissimo il contrario). Se il rapporto 260/230 è così basso vuol dire che hai delle contaminazioni da sale (da acetato di sodio nel tuo caso), quindi dovresti ripetere la fase di Desalting. Questa fase è IMPORTANTISSIMA per ottenere dei valori tra 1.8 e 2.1. Quando metti il tampone per il desalting devi essere preciso e metterlo proprio al centro del tubo in cui hai il tuo RNA (nel senso che, se parte del tuo tampone va a finire sulle pareti del tubo non va per niente bene). E' normale che con questa procedura tu perda tantissimo RNA, però è meglio averne poco ma buono. L'estrazione che faccio io la faccio a 4 °C e/o a temperatura ambiente, dipende dai passaggi e non a -80 °C.

Il sapere non viene da solo, bisogna ricercarlo.
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