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 Defosforilazione vettore pGL3 con SAP
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Tag   clonaggio    SAP    ligazione  Aggiungi Tag

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Musetta_89
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21 Messaggi

Inserito il - 02 gennaio 2017 : 14:25:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Musetta_89 Invia a Musetta_89 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti.
Anche se siamo ancora in clima natalizio sto giÓ pensando agli esperimenti da fare al mio rientro in lab
Dunque, sto facendo dei clonaggi con degli ampliconi di dimensioni comprese fra 400 e 1000 bp in vettori pGL3 basic vector (Promega) ed ho utilizzato fino ad ora un protocollo che prevede:
- purificazione della PCR
- digestione enzimatica
- purificazione della digestione enzimatica
- ligazione o.n. a 16░C
Tuttavia ho avuto molti problemi con le trasformazioni (poche colonie, vettore che si Ŕ richiuso su se stesso senza incorporare il frammento..), per cui, per quanto non strettamente necessario, mi Ŕ stato suggerito di defosforilare il vettore prima della ligazione.
In laboratorio dispongo di un enzima SAP della ditta EuroClone che per˛ fa parte di un kit per il clean up della PCR (in coppia con la ExoI per intenderci). Secondo voi posso tentare di mettere a punto un protocollo con questo enzima?
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