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 Estrazione proteine con Laemmli
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janisfree
Nuovo Arrivato



29 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2017 : 16:41:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di janisfree Invia a janisfree un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti.

Sto cercando un protocollo valido per l'estrazione di proteine di cellule animali adese da una 6-wells plate usando direttamente il Laemmli.
Io sono abituata ad estrarre con RIPA buffer, ma ho scoperto che c'è questa alternativa.
Qualcuno me la potrebbe spiegare nel dettaglio? Grazie mille :)

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1531 Messaggi

Inserito il - 18 febbraio 2017 : 17:31:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mah...direi che metti una certa quantità di laemmli direttamente sulla piastra e screpi, poi centrifughi per eliminare le membrane.
Ma non puoi fare un dosaggio proteico, quindi non so quanto sia utile.
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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


996 Messaggi

Inserito il - 19 febbraio 2017 : 11:50:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si di solito il principale svantaggio è proprio che ottieni campioni non dosabili. Però se parti da un numero di cellule del tutto paragonabile tra i tuoi campioni puoi sperare di normalizzare il risultato con una proteina housekeeping se devi farci un western-blot (semplicemente usando lo stesso volume di Laemmli e caricando lo stesso volume nel gel). Il vantaggio è che si tratta di una lisi e estrazione immediata e piuttosto forte, quindi rischi meno che la tua proteina si degradi e solitamente ottieni estratti piuttosto concentrati. Di solito con questo metodo liso le cellule in Laemmli2x, e dopo aver recuperato il campione lo sonico brevemente per frammentare il DNA genomico che altrimenti ti rende impossibile un caricamento "pulito" sul gel. Poi solita bollitura a 95°C e centrifugata a massima velocità prima di caricare.


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CrackTheBrain
Nuovo Arrivato



6 Messaggi

Inserito il - 15 aprile 2017 : 10:58:17  Mostra Profilo Invia a CrackTheBrain un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scritto da MolecularLab Mobile

Ciao Geeko, una curiosità,come mai centrifughi prima di caricare? Hai notato dei miglioramenti facendolo? Perché io solitamente ometto il passaggio della centrifugazione e ottengo comunque campioni puliti in W.blot
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