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square-fab
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4 Messaggi

Inserito il - 17 marzo 2017 : 16:31:21  Mostra Profilo Invia a square-fab un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Buonasera a tutti, sto approcciando alla rt-pcr in modo teorico e premetto che non devo utilizzare tale tecnica in laboratorio, però mi premeva capire bene la teoria.
Ho un problema sul normalizzatore. In pratica ho capito che se questo in teoria è espresso con gli stessi livelli nei miei campioni, la misura relativa del gene di interesse è veritiera.
Però mi chiedevo materialmente che si fa. Dopo aver estratto gli rna e aver retrotrascritto, metto nelle mie provette sia i primer per il gene housekeeping sia per quello di interesse, amplifico e faccio una corsa elettroforesica.
Quello che non mi figuro è la parte successiva.
Se io ho che i geni HK hanno lo stesso livello di espressione vuol dire che ho messo la stessa quantità di materiale genetico all'inizio ? Poi cosa si fa si da per veritiera la differente espressione del gene di interesse ?
Se invece così non fosse che operazioni di correzione bisogna fare ?
Grazie mille a chi si prende la briga di rispondere e buona serata.

Caffey
Utente Attivo

ZEBOV

Città: Glasgow


1480 Messaggi

Inserito il - 20 marzo 2017 : 14:48:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Caffey Invia a Caffey un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao! Premetto che non è molto che lavoro con la PCR ma provo comunque ad aiutarti.
Non ho ben seguito il tuo discorso quindi cerco di descriverti il procedimento (almeno come lo facciamo qui).
1. Estrazione RNA
2. Diluizione RNA Qui comincia la prima fase delicata. Per poter retrotrascrivere a cDNA è necessario avere un giusto rapporto tra RNA e il master mix di retrotrascrizione (primer random, nucleotidi ed enzima). Per farlo si porta l'RNA estratto ad una concentrazione uguale nei diversi campioni. Questo si ottiene misurandone la concentrazione e poi diluendo nella giusta quantità di H2O.
La corsa elettroforetica di cui parli serve per assicurarsi che l'RNA sia integro e non degradato. Siccome la grande maggioranza dell'RNA che estrai dalle cellule è rRNA, sul gel dovresti vedere due chiare bande corrispondenti alle subunità dell'RNA ribosomiale, in particolare ci interessano 28S e 18S (ovviamente se parliamo di eucarioti). Se le vedi ben chiare, in un rapporto 2:1, vuol dire che il tuo RNA è intatto, se vedi una colorazione su tutta la corsa vuol dire che si è degratato. Più di questo non ti so dire e comunque noi non lo facciamo perché vediamo direttamente il risultato dell'amplificazione.
3. Retrotrascrizione Come dicevo sopra, si prende una quantità (a questo punto nota) di RNA, si aggiunge il master mix e si processa con un termociclatore, con formazione di cDNA.
4. Amplificazione Qui entra in gioco la questione del normalizzatore. I geni HK vengono trascritti dalla cellula in quantità costanti, indipendentemente (o quasi) dagli stimoli cui sono sottoposte e quindi la loro concentrazione riflette la quantità totale di materiale genetico iniziale che è stato amplificato. Se abbiamo prelevato quantità uguale di RNA nei vari campioni, dovremmo quindi avere una quantità di gene HK uguale in tutti i campioni, a prescindere dalla condizione cui sono stati sottoposti. Tuttavia la nostra precisione è scarsa e quindi, misurando il gene HK nei vari campioni, è possibile che ci siano delle differenze di 1-2 cicli tra le varie condizioni. Per tale ragione, al fine di rendere più recisa la nostra misurazione, è importante normalizzare il valore che otteniamo nei geni di interesse, con quello del gene HK.
5. Quantizzazione Per misurare la quantità di copiepresenti si aggiunge alla reazione un colorante fluorescente intercalante, ovvero una molecola che emette fluorescenza solo quando si lega a DNA in doppio filamento: maggiore è la fluorescenza, maggiore è la quantità di DNA amplificata. La quantizzazione vera e propria può essere eseguita con diversi metodi, in modo assoluto (numero di copie) o relativo (variazione del numero di copie rispetto ad un controllo negativo (ad esempio, cellule trattate con un farmaco rispetto a celulle non trattate).
Nel primo caso si utilizza una curva di taratura utilizzando dei campioni con quantità note di materiale genetico e si confronta con essa il valore ottenuto con i nostri campioni. Nel secondo caso si utilizza un valore, detto Ct, che rappresenta il numero di cicli dopo i quali la curva di amplificazione comincia ad avere un andamento esponenziale (in genere viene definita dal software, anche se è possibile valutarla manualmente); nauralmente minore è il valore (meno cicli) e maggiore è la quantità di cDNA che era presenza nel campione iniziale.

Spero di aver chiarito un minimo il tuo dubbio. Chiedi pure se qualcosa non si capisce e proverò a spiegare, nei limiti delle mie conoscenze.
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