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le990
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2017 : 10:59:53  Mostra Profilo Invia a le990 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Buongiorno a tutti,
ho alcuni problemi con la melting curve di un gene...vi allego immagine per essere più chiara...mi si forma un prodotto aspecifico..secondo voi è legato a dimessi di primers? ho provato ad alzare la temperatura fino a 63°C... avete suggerimenti in merito? come posso procedere? secondo voi devo ridisegnare i primers?
grazie per chi potrà aiutarmi

Immagine:

1197233

Caffey
Utente Attivo

ZEBOV

Città: Glasgow


1480 Messaggi

Inserito il - 08 ottobre 2017 : 11:38:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Caffey Invia a Caffey un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao.
Spero che qualche moderatore incroci questa discussione e riduca le dimensioni dell'immagine che hai caricato.
In ogni caso a me il primo picco sembra proprio dei dimer di primer.
Se non ti dispiace, potresti dirci la sequenza dei tuoi primer cosicché possa verificare una cosa?
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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


996 Messaggi

Inserito il - 08 ottobre 2017 : 11:52:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Anche a me sembra un dimero, hai provato a caricare su gel il prodotto di PCR? Puoi provare a testare altre temperature di annealing, più alte di 63°C. Se il tuo termociclatore te lo consente puoi provare con un gradiente usando anche varie diluizioni (di 10 in 10) di un campione di prova per testare anche l'efficienza e con una singola corsa magari trovi già la temperatura ottimale.


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GFPina
Moderatore

GFPina



8324 Messaggi

Inserito il - 10 ottobre 2017 : 18:12:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Caffey

Spero che qualche moderatore incroci questa discussione e riduca le dimensioni dell'immagine che hai caricato.


Fatto!

Comunque, sì anche a me sembrano dimeri di primers!
Mi associo alle risposte precenti.
Dovresti anche analizzare i tuoi primers con un programma di analisi di primers per vedere se formano dimeri.
Inoltre puoi fare delle PCR end-point a diverse temperature per cercare di risolvere il problema e trovare le condizioni ottimali prima di rifare la real-time.
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le990
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 12 ottobre 2017 : 16:48:42  Mostra Profilo Invia a le990 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie per le vostre risposte,
ho inserito i primers nel programma "Amplify" e non sembrano formare dimeri...proverò comunque ad alzare la temperatura come mi avete suggerito...se avete altri suggerimenti sono ben accetti :)
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