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Bio_89
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3 Messaggi |
 Inserito il - 30 ottobre 2017 : 19:23:16
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buonasera, vorrei un aiuto nell'interpretare il profilo termico che mi impone il protocollo per l'amplificazione :
-1 ciclo 50 gradi per 2min
-1 ciclo 95 gradi per 10 min
-50 cicli: 95 gradi per 15 sec ; 60 gradi per 1 min
ho letto che il ciclo a 50 gradi è di decontaminazione; quello a 95 di denaturazione del DNA; per quanto riguarda i 50 cicli , a 95 c'è la denaturazione, a 60 annealing. Ora mi chiedo, non manca lo step con i 72 gradi della taq polimerasi? aiutatemi, sono in tesi e del resto nemmeno il mio prof. sa spiegarsi questo profilo termico perchè si aspettava gli step standard con le temperature standard. grazie
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2017 : 12:28:57
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Ma da dove viene questo profilo termico?
Che enzima viene utilizzato?
Che tipo di PCR è?
Dall'elevato numero di cicli sembra una real-time.
Ma con SYBR green o con sonde?
Se ci dai maggiori dettagli è più facile darti una risposta più precisa e corretta.
Comunque in generale si possono fare PCR a 3 step o a 2 step in cui lo step di anealing e allungamento vengono fatti assieme ad un unica temperatura.
Dipende anche dalla DNA polimerasi che utilizzi (a che T lavora).
Comunque sia per una Taq 60° è un po' bassa, la sua temperatura ottimale è 72°C, ma l'enzima funziona lo stesso, anche se è più lento, quindi comunque la PCR funziona. |
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Bio_89
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2017 : 13:21:33
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grazie per aver risposto e mi scuso per i pochi dettagli, ma l'ansia sta prendendo il sopravvento.
si tratta di una real-time pcr con l'utilizzo di sonde taqman
il profilo termico è preso dal kit( della casa p eurospital) per l'herpes simplex di tipo 1.
lo strumento di real time utilizzato è l 'applied biosystems 7500 |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 31 ottobre 2017 : 17:02:02
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Ok!
Allora posso aggiungerti altre motivazioni.
1) in genere il protocollo a 2-step viene preferito per i kit diagnostici perché è più veloce. Quindi i protocolli vengono messi a punto in questo modo, in modo da ottimizzare.
2) in real-time in genere hai ampliconi abbastanza corti e quindi si amplificano bene anche con una temperatura "non ottimale" per la polimerasi
3) il sistema Taqman si basa sulla degradazione della sonda, la sonda si lega alla temperatura di annealing (come i primers) e deve essere degradata dalla polimerasi che avanza. Quindi se la sintesi da parte della polimerasi avviene alla temperatura di annealing, la sonda è sicuramente attaccata ed è favorita la sua idrolisi.
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Bio_89
Nuovo Arrivato
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profilo termico real time pcr
Didattica
Inserito il - 01 novembre 2017 : 15:04:00
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