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Caos
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2 Messaggi

Inserito il - 30 dicembre 2017 : 17:37:50  Mostra Profilo Invia a Caos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Buongiorno a tutti,
ho bisogno di purificare le IgG a partire da un siero (o un pool di sieri). In un lavoro simile a quello che vorrei portare avanti utilizzano 5 ml di protein A Sepharose (Zymed Laboratories).

Credo si tratti di questo: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101041

Ora, considerando che io non ho nessuna esperienza di questo tipo, mi sapreste indicare da dove studiare un protocollo?

Il lavoro che sto usando come riferimento dice:
Citazione:
Five ml of protein A Sepharose (Zymed Laboratories) was incubated with 10 ml of pooled serum on a rocking platform for 2 h at 22°C. The protein A Sepharose and adsorbed proteins were then loaded into a column and washed with 10 mM sodium phosphate and 150 mM NaCl (pH 7.4). IgG was eluted with 0.1 M glycine (pH 2.7) into collection tubes that contained 2 M Tris buffer (pH 8.0) so that the final pH was adjusted to pH 7.0. Protein concentrations were determined by bicinchoninic acid assay (Sigma-Aldrich).

ma non ho ben capito come procedere.

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8360 Messaggi

Inserito il - 03 gennaio 2018 : 17:56:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Innanzitutto da che specie devi purificare le IgG?
Se si tratta di IgG umane ti consiglio la proteina G piuttosto che la proteina A. Lega meglio e sopratutto tutte le sottoclassi di IgG e non lega le IgA, cosa che invece fa la proteina A.
Comunque ci sono delle tabelle di affinità delle varie proteine (A, G, L ...) alle varie Ig, una la trovi anche nel data siete del prodotto che hai linkato, consultale prima di decidere cosa usare.
Poi, quante IgG devi purificare?
Nel protocollo che hai citato usano 10 ml di siero, mi sembra una quantità molto elevata.
Comunque in generale le proteine A e G sono coniugate ad una resina di Agarosio o di sefarosio e vengono utilizzate in cromatografia.
Tu hai delle colonne per cromatografia?
Altrimenti puoi fare tutto in provetta centrifugando per far precipitare la resina, ma è più complesso e quando recuperi devi stare molto attento a non prendere su anche la resina.
Nel protocollo che hai citato, fanno avvenire il legame in provetta e poi caricano su una colonna per i lavaggi e l'eluizione.
Esistono anche delle colonnine già pronte, ad es queste:
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20356
Ma ne esistono tantissime, di varie marche.
Probabilmente, se sei alle prime armi può essere più semplice usare questo tipo di prodotto.
Poi ci sono anche le "spin-column" che sono in formato provetta da 1,5-2ml che va in centrifuga. Sono pratiche, ma per piccole quantità.

Comunque per farla un po' breve, il protocollo non è altro che questo:
(Che è anche quello che c'è nell'articolo)
1) fai legare le Ig alla proteina A o G mettendo il siero in incubazione con la resina con la proteina A o G
Questo può essere fatto mettendo la resina e il siero in incubazione, meglio se in agitazione ad es. su una ruota da emocromo. Il tempo dipende dall'affnità tra IgG e proteina A o G.
Oppure puoi far passare il siero direttamente nella colonna contenente la resina.
2) lavi per eliminare quello che si è legato in modo aspecifico, quindi usi un buffer ad es sodio fosfato (come dicono nell'articolo) o PBS (che é sempre un buffer con fosfato) in presenza di "sale" (NaCl). Nell'articolo hanno aggiunto 150 mM NaCl, se usi PBS c'è già NaCl 137 mM, ma meglio comunque portarlo almeno a 150 mM. Il sale aiuta a rimuovere gli aspecifici che si possono essere legati.
3) eluisci (quindi fai staccare) le Ig dalla resina utilizzando un pH basso. In genere si usa Glicina 0,1 M portata a pH 2,7 - 3 con HCl.
4) a questo punto hai le Ig purificate che però sono in un tampone acido e potrebbero rovinarsi, devi quindi immediatamente neutralizzare il pH utilizzando un buffer basico in genere Tris a pH 8-9.
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Caos
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2 Messaggi

Inserito il - 04 gennaio 2018 : 09:53:11  Mostra Profilo Invia a Caos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie GFPina,
Citazione:
Messaggio inserito da GFPina

Innanzitutto da che specie devi purificare le IgG?

devo purificare le IgG da siero di cane, quindi penso proteina A.

Citazione:
Messaggio inserito da GFPina

Poi, quante IgG devi purificare?
Nel protocollo che hai citato usano 10 ml di siero, mi sembra una quantità molto elevata.

Effettivamente mettere insieme 10ml di siero per me non è facilissimo, puntavo appunto a studiare un protocollo che mi permettesse anche di ridurre le quantità.
La concentrazione finale delle IgG non è un grosso problema perché per l'immunofluorescenza, ELISA e western diluisco comunque un bel po' i sieri, quindi posso giocare su quello.

Citazione:
Messaggio inserito da GFPina

Tu hai delle colonne per cromatografia?

No, punto a comprare un kit con già tutto pronto

Citazione:
Messaggio inserito da GFPina

Esistono anche delle colonnine già pronte, ad es queste:
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20356
Ma ne esistono tantissime, di varie marche.
Probabilmente, se sei alle prime armi può essere più semplice usare questo tipo di prodotto.
Poi ci sono anche le "spin-column" che sono in formato provetta da 1,5-2ml che va in centrifuga. Sono pratiche, ma per piccole quantità.


Tipo questi sì!


Grazie per la risposta!
Mi faccio un giro sul sito di qualche produttore e vedo un po' cosa mi offre
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