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brambifix
Nuovo Arrivato



13 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2018 : 15:53:27  Mostra Profilo Invia a brambifix un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Buongiorno, devo fare un analisi western blot per quantificare una determinata proteina che è espressa molto poco, anche con un secondario HRP e femto ECL non riesco ad aver dei segnali puliti il più delle volte. Posso amplificare il segnale emesso da un anticorpo fluorescente, esistono anticorpi secondari con più fluorocromi attaccati, che cosa mi consigliereste in una situazione infelice come questa?
Grazie

Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1029 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2018 : 19:51:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Intanto non hai modo di arricchire il campione per la tua proteina? Tipo tramite frazionamento cellulare, dissezione o microdissezione, concentrazione etc?


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brambifix
Nuovo Arrivato



13 Messaggi

Inserito il - 13 febbraio 2018 : 09:40:40  Mostra Profilo Invia a brambifix un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No purtroppo, non si parla di cellule ma di esosomi (lisati e non) e ne ho una aliquota di 500Ul per tre diversi frazionamenti con SEC. per quanto riguarda il campione ho le mani legate e anche cercare di coltivare più cellule non porta a miglioramenti.
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1634 Messaggi

Inserito il - 13 febbraio 2018 : 19:54:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Pff...ho lavorato sugli esosomi per un periodo...sono una rottura...
Purtroppo credo che le uniche due opzioni siano:
- partire da un volume maggiore di terreno
- cambiare tecnica di purificazione (non so se stai facendo centrifugazione, ma vendono un sacco di kit a riguardo)
- trovare un anticorpo primario con una maggiore affinità

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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brambifix
Nuovo Arrivato



13 Messaggi

Inserito il - 15 febbraio 2018 : 09:50:43  Mostra Profilo Invia a brambifix un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La tecnica di purificazione consiste in una concentrazione in centrifuga e una cromatografia SEC, secondo me aumentare il volume di terreno porta sola ad avere un campione più diluito, tanto per la raccolta lascio le cellule per 24h in quel terreno, quindi la frazione di esosomi rilasciati non penso che cambi considerevolmente con ancora più terreno. Si effettivamente ci sono parecchie difficoltà con ste nanoparticles.
Grazie dei consigli
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