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 TOPO KO con crispr cas9
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leviGFP
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Inserito il - 30 marzo 2018 : 12:36:36  Mostra Profilo Invia a leviGFP un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, sono una studentessa di biotecnologie alle prese con un articolo di genetica. Ho due domande per voi:

1)nella produzione di un topo transgenico utilizzando CRISPR/CAS9, vengono utilizzate sia la GFP che la TdTomato per seguire l'espressione di CAS9 in cardiomiociti. Non capisco, per˛, per quale motivo vengano utilizzate entrambe.

Io suppongo che si tratti di un'operazione di immunofluorescenza. La GFP viene legata ad un anticorpo che riconosce un determinato antigene sul tessuto. per˛, richiede una precendente fase di fissaggio al tessuto con paraformalmide al 4% che potrebbe camuffare gli epitopi e quindi inficiare sul riconoscemento antigene - anticorpo. per questo motivo viene utilizzata la Tdtomato in alternativa, per avere una chance in pi¨ di seguire la reazione nel caso in cui la GFP non dovesse funzionare.
La pensate come me?

2) quando viene utilizzata la tecnica CRISPR cas9, la cas9 induce il DSB e successivamente la cellula provvede a riparare il taglio tramite o ricombinazione omologa o NHEJ. -
Nel caso della ricombinazione omologa, il filamento di DNA templato che servirÓ per la ricombinazione, viene fornito sotto forma di vettore? non riesco a capire dove la cellula possa prendere il DNA da ricombinare.
vi allego anche l'articolo nel caso in cui vogliate leggerlo.

Grazie a chiunque proverÓ a darmi una mano.


Allegato: PNAS-2016.pdf
2196,21áKB
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