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Pirof
Nuovo Arrivato



5 Messaggi

Inserito il - 26 giugno 2018 : 12:31:42  Mostra Profilo Invia a Pirof un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti,sono nuova nel forum e sono disperata
è più di un mese che combatto con un clonaggio batterico senza ottenere alcun risultato, nel senso che non ottengo colonie!!!
il clonaggio di per se è semplice, si parla di una doppia digestione che crea estremità blunt per inserire un frammento di 2600bp in un vettore di 7914bp... Le ho provate tutte, ho persino rifatto da capo il tae per la corsa elettroforetica temendo che ci fosse qualcosa che inibisse la ligasi, ho comprato la ligasi nuova pensando che avessi rovinato la mia magari tenendola troppo fuori dal -20°, ho cambiato tutti i buffer infine ho digerito solo il vettore e ho messo su la ligasi su se stesso per verificare l'efficienza della ligasi confrontandolo con il non ligato risultato che ho delle colonie ma solo di quello senza ligasi
non so più che devo fare!!!
p.s. ovviamente ho anche rifatto le cellule competenti per la trasformazione e valutata l'efficienza...
aiuto vi prego

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1701 Messaggi

Inserito il - 26 giugno 2018 : 13:10:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Clonaggi...gioie e dolori.
Io ci sono passato piu' volte, alcuni clonaggi che sembrano difficilissimi riescono al primo tentativo, altri semplicissimi non ne vogliono sapere.
Il perche' non lo so.
Citazione:

ho digerito solo il vettore e ho messo su la ligasi su se stesso per verificare l'efficienza della ligasi confrontandolo con il non ligato risultato che ho delle colonie ma solo di quello senza ligasi


Immagino tu voglia dire solo quello CON la ligasi...no?!
Quante colonie ti sono uscite? 10? 100? 1000?
Ti da' un idea di quanto sono efficienti le tue cellule. Cosi' ad occhio direi che dovrebbero venirti >100 colonie (ovviamente dipende da quanti batteri hai piastrato). Se sono meno una parte del problema potrebbe essere li e magari vale la pena ottimizzare i batteri competenti (o comprarli gia' competenti)

Ricontrolla gli enzimi, se tagliano e danno estremita' blunt (tutti). Hai fatto ligasi a diverse temperature? Pare che le estremita' blunt si ligano meglio a 10 gradi ON. Ridisegna il clonaggio se puoi, usando diversi enzimi (magari con sticky ends, dovrebbe essere piu' facile).
Come regola generale, cambia condizioni, non ripetere sempre la stessa cosa:
"Follia è fare sempre la stessa cosa ed aspettarsi risultati diversi."
(Citazione spesso attribuita erroneamente ad Einstein)

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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Pirof
Nuovo Arrivato



5 Messaggi

Inserito il - 26 giugno 2018 : 17:33:26  Mostra Profilo Invia a Pirof un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da domi84

Clonaggi...gioie e dolori.
Io ci sono passato piu' volte, alcuni clonaggi che sembrano difficilissimi riescono al primo tentativo, altri semplicissimi non ne vogliono sapere.
Il perche' non lo so.
Citazione:

ho digerito solo il vettore e ho messo su la ligasi su se stesso per verificare l'efficienza della ligasi confrontandolo con il non ligato risultato che ho delle colonie ma solo di quello senza ligasi


Immagino tu voglia dire solo quello CON la ligasi...no?!
Quante colonie ti sono uscite? 10? 100? 1000?
Ti da' un idea di quanto sono efficienti le tue cellule. Cosi' ad occhio direi che dovrebbero venirti >100 colonie (ovviamente dipende da quanti batteri hai piastrato). Se sono meno una parte del problema potrebbe essere li e magari vale la pena ottimizzare i batteri competenti (o comprarli gia' competenti)

Ricontrolla gli enzimi, se tagliano e danno estremita' blunt (tutti). Hai fatto ligasi a diverse temperature? Pare che le estremita' blunt si ligano meglio a 10 gradi ON. Ridisegna il clonaggio se puoi, usando diversi enzimi (magari con sticky ends, dovrebbe essere piu' facile).
Come regola generale, cambia condizioni, non ripetere sempre la stessa cosa:
"Follia è fare sempre la stessa cosa ed aspettarsi risultati diversi."
(Citazione spesso attribuita erroneamente ad Einstein)


Purtroppo non mi sono confusa, è proprio quello SENZA ligasi che mi ha dato colonie (poco più di una decina) mentre quello CON la ligasi 0... Per quanto riguarda il resto, ho controllato che gli enzimi taglino ed ho fatto sempre prove diverse in cui ho cambiato e testato un passaggio diverso per volta, l'unica cosa non ancora tentata è cambiare la temperatura, in effetti ligo sempre a 15°, proverò con altre temperature, grazie mille per il suggerimento
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1701 Messaggi

Inserito il - 26 giugno 2018 : 21:45:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mmm...interessante...
Mi dà l'idea che la tua reazione uccida i batteri.
Inattivi la ligasi prima di trasformare i batteri? Pare che alcune ligasi siano tossiche per i batteri e di solito hanno una procedura di inattivazione a 65°C.

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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Pirof
Nuovo Arrivato



5 Messaggi

Inserito il - 27 giugno 2018 : 12:34:09  Mostra Profilo Invia a Pirof un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Onestamente non ho pensato di inattivare la ligasi, poiché è un ezima che usiamo da anni e non ha mai dato particolari problemi sui batteri che utilizzo, anche con clonaggi molto più complessi...In ogni caso è un suggerimento interessante e proverò ad inattivare la ligasi prima di trasformare....grazie ancora
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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 27 giugno 2018 : 21:08:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Hai già provato a fare in parallelo una ligazione di controllo con un vettore diverso dal tuo (meglio se tagliato con gli stessi enzimi). Ci sono dei costrutti particolarmente tossici per i batteri (specie se vettori di espressione). In quel caso ti consiglio di cambiare ceppo anche per il clonaggio, magari prova le JM109.


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