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 IMMUNOPRECIPITAZIONE SEGUITA DA WESTERN BLOT
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marika castagnola
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2 Messaggi

Inserito il - 19 luglio 2018 : 22:10:21  Mostra Profilo Invia a marika castagnola un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti ragazzi, sto analizzando un articolo di ricerca dal titolo ''The long non-coding RNA Paupar promotes KAP1-dependent chromatin changes and regulates olfactory bulb neurogenesi'', ed alcune cose non mi sono molto chiare, spero che qualcuno di voi abbia la pazienza di aiutarmi. riassumendo molto brevemente in questo articolo gli scienziati arrivano a dimostrare l'interazione sul DNA di PAX6-PAUPAR (lnRNA)- KAP1 (allego la foto); questa interazione ha una serie di conseguenze e scopi.

Immagine:

90,52 KB

ORA IL PUNTO E': prima di affermare con certezza questa interazione sono state usate una serie di tecniche per studiare l'interazione tra proteine, la mia difficoltà è principalmente per la seguente tecnica, (soprattutto per la lettura dei risultati del gel).

per determinare se la proteina PAX6 si lega a KAP1 o RCOR3, è stata eseguita una IMMUNOPRECIPITAZIONE (seguita da western blot): un campione di cellule N2A è stato trasfettato con vettore che esprime FLAG-PAX6+KAP1, e l'altro campione con vettore FLAG-PAX6+RCOR3. i risultati hanno dimostrato che PAX6 si lega a KAP1.
Allego l'immagine dei risultati del WESTERN che non riesco ben ad interpretare.

Immagine:

62,34 KB

le mie domande sono:
1) cosa rappresenta l'input?
2) perche in WB:KAP1 FLAG-PAX6, KAP1, e FLAG-PAX6+KAP1 sembrano non essere presenti? (lo stesso accade negli altri WB)
3) inoltre se è stato dimostrato che pax6 si lega a KAP1, perche la linea FLAG-PAX6+KAP1 è molto più ''magra'' rispetto alla linea FLAG-PAX6+RCOR3?

Mi scuso se le mie domande possano sembrare un po banali,sicuramente per alcuni di voi lo saranno, ma frequento il primo anno di magistrale e non ho molta dimestichezza con l'interpretazione dei risultati di una immunoprecipitazione.

UN GRAZIE IMMENSO A CHIUNQUE DEDICHI UN Pò DEL SUO TEMPO A LEGGERE LA MIA DOMANDA E AD AIUTARMI A COMPRENDERE CORRETTAMENTE I RISULTATI. GRAZIE ANCORA RAGAZZI, BUONA SERATA.

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1710 Messaggi

Inserito il - 20 luglio 2018 : 21:36:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao marika e benvenuta sul forum.
Partiamo dall'immunoprecipitazione in generale (Maggiori info qui: https://en.wikipedia.org/wiki/Immunoprecipitation):
L'estratto proteico sono tutte le proteine di una cellula (questo è quello che si chiama input o totale). Da queste immunoprecipiti (cioè tiri via con un anticorpo legato ad una "biglia di plastica") la tua proteina d'interesse (in questo esperimento FLAG-PAX6) per vedere se la seconda proteina di interesse viene giù con la prima (in questo caso KAP1 o RCOR3).
Prima di guardare il risultato si fanno una serie di controlli per essere sicuri che niente sia andato storto: Si caricano TUTTI gli input per dimostrare che le proteine erano presente in origine prima dell'immunoprecipitato, si verifica che hai realmente immunoprecipitato la prima proteina di interesse, si dimostra che non hai nessuna banda se trasfetti solo la seconda proteina (o comunque una piccola piccola come in questo caso), infine si guarda al risultato (dove hai trasfettato le due proteine contemporanemte).

Citazione:

1) cosa rappresenta l'input?


In questo caso è stato usato solo per dimostrare che l'anticorpo funzioni (se immagini il secondo wb senza l'input sarebbe un panello bianco, potrebbe far pensare che c'è stato un problema). Questo però non è sufficiente.
Immaginiamo (per finta) che Pax6 induca la degradazione di RCOR3, o che l'operatore per errore ha dimenticato di trasfettare RCOR3 nell'ultima lane, questo esperimento apparirebbe nello stesso identico modo. Caricando invece l'input di ogni estratto prima dell'immunoprecipitazione dimostri che l'unica spiegazione possibile è che non interagiscono.

Citazione:

2) perche in WB:KAP1 FLAG-PAX6, KAP1, e FLAG-PAX6+KAP1 sembrano non essere presenti? (lo stesso accade negli altri WB)


Scusa, ma non ho capito questa domanda...

Citazione:

3) inoltre se è stato dimostrato che pax6 si lega a KAP1, perche la linea FLAG-PAX6+KAP1 è molto più ''magra'' rispetto alla linea FLAG-PAX6+RCOR3?


Mai mai mai MAI mai mai mai MAI MAI mai mai e poi mai comparare bande che non sono sulla stessa membrana. Mai. Il western ha una serie di passaggi che possono portare una grossa variabilità (a partire dalla trasfezione), inoltre i tempi di esposizione possono essere diversi, quindi MAI comparare bande su membrane diverse.
Inoltre credo tu stia parlando dei pannelli inferiori (giusto?!) ma quelli sono solo i controlli che l'anticorpo ha immunoprecipitato pax6, l'esperimento vero e proprio è solo l'ultima colonna del panello superiore (di ogni wb), il resto sono solo controlli.

Citazione:

prima di affermare con certezza questa interazione


Diciamo che si poteva fare meglio e lasciare meno dubbi

Citazione:

UN GRAZIE IMMENSO A CHIUNQUE DEDICHI UN Pò DEL SUO TEMPO


po'

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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marika castagnola
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 21 luglio 2018 : 20:55:50  Mostra Profilo Invia a marika castagnola un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille domi84 per la risposta chiara ed esaustiva.
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