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nunyfra
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Inserito il - 16 aprile 2007 : 13:16:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di nunyfra Invia a nunyfra un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Buongiorno a tutti!
Sono una neodottoranda e in quest'ultimo periodo sto lavorando sull'espressione di proteine angiogeniche nei mastociti umani derivanti dal polmone. Qualcuno putrebbe darmi dei consigli su come risolvere il problema (è la seconda volta che mi capita) che vi spiego di seguito?

Al termine del western blot nella lane corrispondente a queste cellule non c e niente. (Cosa che puo essere!!!). Purtroppo, pero, quando vado a valutare l'espressione del GAPDH, manca anche essa. Problema che non si verifica con due linee mastocitarie (LAD-2 ed HMC-I). (ho caricato sempre circa 35 mcg di proteine/lane)

Premetto che si lavora con circa 0,5x10^6 - 10^6 cells pure e che il lysis buffer usato è il seguente TRIS 20 mM, NaCl 150 mM, NaF 10 mM, EDTA 5 mM, NP-40 1%, Glicerolo 5%, Benzamidina 2 mM, Na3VO4 10 mM, PMSF 1 mM, Leupeptina 30 mcg/ml, Aprotinina 30 mcg/ml.

La prima volta credevo di aver diliuto troppo il lisato cellulare per cui la seconda volta l'ho ridotto della meta. L'impressione è che fosse piu gelatinoso al termine dell'estrazione delle proteine (rispetto alla prima volta).

Secondo voi è piu verosimile che sia un problema determinato dalla metodica di purificazione delle cellule (selezione immunomagnetica positiva per CD117)?

Complimenti per il sito!!
Grazie a tutti in anticipo.


chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 16 aprile 2007 : 14:06:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Strano... ma hai altri campioni che facciano da controllo positivo? Se li estrai in parallelo e non vedi nulla allora è probabilmente un problema di estrazione, mentre se nel controllo positivo c'è qualcosa allora potrebbe essere la purificazione (anche se non vedo come possa sparire il GAPDH).

Magari prova a usare un altro housekeeping, ad es. beta actina.

Questo è il protocollo che usavo io per l'estrazione di proteine:
http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=11
il buffer sembra molto simile al tuo, comunque dacci un'occhiata, magari torna utile :D


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nunyfra
Nuovo Arrivato



4 Messaggi

Inserito il - 16 aprile 2007 : 14:45:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di nunyfra Invia a nunyfra un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Purtroppo i miei controlli positivi sono acquistati gia come lisati cellulari. Comunque ho lisato in parallelo le LAD-2 e le HMC-I con cui non ho avuto problemi. Proverò magari a controllare qualche altra proteina housekeeping. Eppure io ho forti dubbi che il problema stia nell'incubazione delle cellule con l'anticorpo anti CD-117 e nella colonna magnetica..... Ma come faccio a dimostrarlo?
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 16 aprile 2007 : 22:27:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Puoi usare altri 2 gruppi di cellule
Un gruppo lo lasci con l'anticorpo anti CD-117 ed estrai le proteine senza il passaggio su colonna.
Un altro gruppo lo passi nella colonna senza il passaggio nell'anticorpo.

In questo modo puoi vedere se uno di quei passaggi fa qualcosa di strano...

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