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alexct82
Nuovo Arrivato
Prov.: ct
Città: catania
26 Messaggi |
 Inserito il - 19 aprile 2007 : 09:21:13
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Ciao a tutti.Sto cercando si effettuare l'elettrotrasfer di proteine da un SDS-PAGE a una mambrana di nitrocellulosa per poi effettuare il westen blot. In molti protocolli che ho visto on line(e anche nelle istruzioni della cassetta per elettrotrasfert!!!) consigliano di effettuare l'elettrotrasfer a 300-400 mA per 1 ora e mezza. Il rpoblema è che il generatore che abbiamo in laboratorio non riesce ad andare oltre i 150 mA!!!! Come devo fare?qualcuno può aiutarmi???
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
 Inserito il - 19 aprile 2007 : 14:04:24
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in genere il tempo e l'amperaggio che applico sono determinati in base al PM della proteina che cerco. Io mi regolo così: x piccole proteine trasferisco a 250 mA per 1h e 30', mentre per proteine più grandi (sopra i 200 KDa) mi sono trovata bene facendo il trasferimento ON a 28 mA (ricorda poi però di settare anche il voltaggio massimo da far raggiungere al power, per 28 mA(costanti) setto un voltaggio massimo di 30 V).
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2007 : 16:34:20
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in realtà molto dipende anche da quanta proteina pensi di avere;
il trasferimento veloce lascia molte proteine nel gel, specialmente quelle grandi, viceversa il trasferimento ON (16 h) ti garantisce il trasferimento quasi completo, con il rischio (seppur remoto) che proteine veramente piccole (6000 da) attraversino la membrana.
io settavo il voltaggio costante a 30 V (utilizzando una camera BIO-RAD grande con gli elettrodi a filo e non a placche) e mettevo la cameretta in una bacinella con ghiaccio, refrigeranti e un po di acqua per trasmettere il "Freddo" in agitazione in camera fredda.
Se la camera fredda non ce l'hai puoi sostituire la bacinella con una scatola di polistirolo con il coperchio, funziona benissimo.
Se hai invece la cameretta piccola (per trasferire 2 gel piccoli separatamente) metti l'alimentatore a 25 V.
Buon lavoro |
Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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biotech1
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 20 aprile 2007 : 14:33:17
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| Per gel al 14/16% di acrilamide faccio il trasferimento a 50 V per 2h (e mezza) mentre 20 V per 15 h (overnight). Nel primo caso, poichè l'apparato scalda un po', di solito lo piazzo in ghiaccio come già descritto. Se il tampone è nuovo (tris-gly +10% metOH), la corrente non dovrebbe andare sopra i 150-160 mA. |
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Biochica
Utente Junior
285 Messaggi |
Inserito il - 23 aprile 2007 : 12:52:21
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| Mi sa che posso essere poco d'aiuto...io trasferisco a 20V costanti per mezz'ora...ho un semidry però... |
Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit- |
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moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2007 : 11:54:29
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Citazione:
Messaggio inserito da Iside
in genere il tempo e l'amperaggio che applico sono determinati in base al PM della proteina che cerco. Io mi regolo così: x piccole proteine trasferisco a 250 mA per 1h e 30', mentre per proteine più grandi (sopra i 200 KDa) mi sono trovata bene facendo il trasferimento ON a 28 mA (ricorda poi però di settare anche il voltaggio massimo da far raggiungere al power, per 28 mA(costanti) setto un voltaggio massimo di 30 V).
Anche nel mio lab,dove in genere blottiamo proteine non superiori ai 100kDa usiamo un voltaggio fisso a 30V,in camera fredda e over night |
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Discussione |
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elettrotransfer di proteine su membrana per wester
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