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Discussione |
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ciottolina
Nuovo Arrivato
Prov.: Varese
Città: varese
35 Messaggi |
 Inserito il - 23 aprile 2007 : 21:42:57
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c'è qualcuno che mi saprebbe spiegare il sequenziamento delle proteine..
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2007 : 11:52:23
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Ammettiamo di avere una seqenza proteica:
ABZCDTEFGHITLZMNOTPQRSTUV (Ho usato le lettere dell'alfabeto...anche se alcune non sono associate ad amminoacidi )
Effettui un taglio con un enzima proteolitico (tipo Tripsina, che taglia in corrisponderza delle T) e otterrai:
ABZCDT
EFGHIT
LZMNOT
PQRST
UV
Ogn'uno di questi frammenti creati avrà un certo peso, dato dalla somma dei singoli pesi degli amminoacidi, quindi:
ABZCDT=1038
EFGHIT=1046
LZMNOT=1057
PQRST=987
UV=376
Il peso dei frammenti viene trovato tramite spettrometria di massa.
Mettendo questi pesi in appositi programmi di bioinformatica viene cercata la proteina di tuo interesse nei database. Casomai la tua proteina non viene trovata, con lo spettrometro di massa puoi anche frammentare i singoli frammenti in amminoacidi e sequenziarli. Ad es:
ABZCDT=1038
sarà frammentato in:
A=160
AB=320
ABZ=540
ABZC=856
ABZCD=987
ABZCDT=1038
quindi facendo le differenze di peso dei frammenti puoi trovare la seq aa.
Spero di essere stato chiaro...purtroppo la cosa è abbastanza complicata...se hai domande chiedi pure. CIAO!!!
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ciottolina
Nuovo Arrivato
Prov.: Varese
Città: varese
35 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2007 : 20:36:06
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| grazie mille,sei stato chiarissimo |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 24 aprile 2007 : 21:52:01
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Scusa Domi, al contrario di ciottolina,io nn sn sicura di aver cpt.. nonostante tu sia stato chiaro.
A me sembrerebbe possibile sequenziare nel modo da te descritto (frammentando singoli frammenti in aa....etc)se gli aa avessero tutti peso diverso!E' così? Oppure dv mi sn persa qlke pezzo?
Grazie in anticipo per il chiarimento |
Ascoltami con gli occhi... |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2007 : 01:08:32
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Citazione:
Messaggio inserito da Gst
Scusa Domi, al contrario di ciottolina,io nn sn sicura di aver cpt..nonostante tu sia stato chiaro.
A me sembrerebbe possibile sequenziare nel modo da te descritto (frammentando singoli frammenti in aa....etc)se gli aa avessero tutti peso diverso!E' così? Oppure dv mi sn persa qlke pezzo?
E' proprio così!!!Gli amminoacidi hanno tutti peso diverso (o quasi):
http://it.wikipedia.org/wiki/Amminoacidi
Se guardi i PM degli aa, puoi notare che solo 2 hanno lo stesso peso: leucina e isoleucina.
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2007 : 01:12:53
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Citazione:
Messaggio inserito da ciottolina
posso farti un'alra domanda?sai come si fa a sintetizzare una sonda di rna antisenso.ho capito bene di come va clonato nel vettore ma non ho capito il procedimento dell'rna polimerasi grazie mille
Ti conviene aprire un altro post per questo...
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2007 : 12:46:07
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| Io per il sequenziamento conoscevo un altro metodo, senza analisi bioinformatica...Si usa un sequenziatore che sfrutta la reazione della degradazione di Edman in condizioni alcaline...A grandi linee si rompono i ponti disolfuro della proteina in esame, e poi si procede con il taglio da parte di proteasi diverse e quindi si formerranno diversi frammenti...Il reattivo di Edman (fenilisotiocianato) etichetta il residuo N-terminale dei frammenti che così in condizioni alcaline diventa instabile e lo fa dissociare, mentre il resto rimane intatto...Il residuo staccato viene identificato e il ciclo riprende...Poi confrontando le sequenze dei frammenti tagliati in modo diverso si riallineano le sequenze ottenute per ottenere la sequenza completa del peptide... |
 
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2007 : 13:08:43
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Citazione:
Messaggio inserito da Schuldiner86
Io per il sequenziamento conoscevo un altro metodo, senza analisi bioinformatica...Si usa un sequenziatore che sfrutta la reazione della degradazione di Edman in condizioni alcaline...A grandi linee si rompono i ponti disolfuro della proteina in esame, e poi si procede con il taglio da parte di proteasi diverse e quindi si formerranno diversi frammenti...Il reattivo di Edman (fenilisotiocianato) etichetta il residuo N-terminale dei frammenti che così in condizioni alcaline diventa instabile e lo fa dissociare, mentre il resto rimane intatto...Il residuo staccato viene identificato e il ciclo riprende...Poi confrontando le sequenze dei frammenti tagliati in modo diverso si riallineano le sequenze ottenute per ottenere la sequenza completa del peptide...
Penso che ormai sia una informazione solo "accademica"...
La reazione di Edman richiede circa 1 ora per staccare un singolo aa...immagina di dover sequenziare una piccola proteina di 80aa...ci vogliono una 80ina di ore...Un po' troppe...
Inoltre questa reazione (se non ricordo male) richiede l'uso di reagenti molto tossici e di una grossa quantità di proteina purificata...
Invece per alcuni odierni (e costosi) spettrometri di massa bastano anche poche femtomoli (10alla-15)di proteina purificata... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2007 : 13:53:09
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Citazione:
La reazione di Edman richiede circa 1 ora per staccare un singolo aa...immagina di dover sequenziare una piccola proteina di 80aa...ci vogliono una 80ina di ore...Un po' troppe...
Veramente con la reazione di Edman credo si riuscisse a fatica a sequenziare peptidi di 20 aa.... figurati 80!  |
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2007 : 14:26:56
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| Si infatti perché è una questione di statistica, non si staccano tutti con certezza, apposta bisogna tagliare con enzimi proteolitici in più "pezzettini"...Cioè, poi io il sequenziamento l'ho studiato così con l'esame di biochimica e il procedimento è preso dal Lehninger... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 aprile 2007 : 22:54:04
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Non fraintenderci, il metodo che hai spiegato è corretto, solo che oramai non viene più usato tantissimo, visto che ci sono tecniche migliori.
Spesso le metodiche avanzano così velocemente che i professori non stanno al passo con i tempi se non le usano normalmente.
Ovviamente il Lenhingher ha un taglio più chimico e non vanno a parlarti di spettrometria di massa che richiederebbe un paio di capitoli solo per essere spiegata propriamente. |
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LaP
Nuovo Arrivato
Città: Milano-Bologna
14 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2008 : 23:40:16
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Ricordo solo che sebbene il sequenziamento Edman sia complicato e limitato a (al massimo) 20/30 aa dell'N terminale, in alcuni casi, specialmetne per le proteine/speci di cui non è disponibile il genoma, risulta essere ancora la tecnica di elezione per l'identificazione.
Questo proprio grazie al sequenziamento specifico dell N terminale che è altamente conservato tra le speci taxonomicamente più vicine. Di conseguenza è possibile una identificazione mediante un blast proteico.
Per quanto le tecniche siano alle volte sorpassate, non sono da disdegnare. Ogni problema ha una sua soluzione ottimale, conoscere tutte le tecniche permette di trovare la soluzione migliore e/o più efficace ad ogni problema.
Buon lavoro |
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Discussione |
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Sequenziamento proteico
Didattica
