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 Phage Display e Titolazione fago M13
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Seph
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Inserito il - 04 febbraio 2020 : 13:29:45  Mostra Profilo Invia a Seph un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti,

Sto svolgendo il tirocinio per la stesura della mia Tesi di Laurea Magistrale. Il progetto a cui sto lavorando si basa sul phage display e, in particolare, sull’utilizzo del fago helper M13K07 combinato ad un fagemide recante il gene codificante per la proteina pIII del fago M13, in cui č sua volta clonata la sequenza codificante per il peptide da esporre sulla superficie del fago. Teoricamente, con questo sistema dovrei riuscire ad isolare virioni in cui solo alcune delle cinque copie della proteina pIII (espresse a partire dal fagemide) recano l’inserto, mentre altre (espresse a partire dal genoma fagico) sono wild-type. Ciascun virione, inoltre, dovrebbe inglobare al suo interno una copia del fagemide, dato che questo presenta un'orgine di replicazione f1. I virioni in questione sono riuscita a precipitarli con PEG, risospenderli in TBS e quantificarli leggendone l'assorbanza, ottenentdo un titolo pari a 1,7*10^12. Mi č stato consigliato, perö, di quantificare questi stessi fagi anche mediante titolazione, oltre che mediante spettrofotometria, e qua sorgono i miei dubbi:
1) Il fago M13 non č un fago litico e il tipo di fago helper che utilizzo non porta marker di selezione quale il gene per la beta-galattosidasi, piuttosto porta il gene che conferisce resistenza alla kanamicina, mentre il fagemide porta il gene che conferisce resistenza all'ampicillina. Dunque, esclusa la possibilitā di contare placche di lisi o colonie colorate, io credo che l'unico modo per titolare i miei fagi sia utilizzarli per infettare nuove cellule, questa volta non trasformate col fagemide, fare delle diluizioni seriali e contare le colonie di cellule che crescono su piastre contenenti sia ampicillina che kanamicina. In questo modo, solo le cellule infettate col fago potranno crescere in presenza di entrambi gli antibiotici. Tutto ciö posso farlo semplicimente piastrando le mie cellule, eppure mi č stato consigliato il metodo Top Agar e il conteggio delle placche. Sul momento, non conoscendo il metodo top agar, non ho avuto modo di fare queste domande, ma adesso non mi č chiaro nč quali vantaggi potrebbe comportare utilizzare questo metodo piuttosto che il normale piastramento, nč in cosa dovrebbero consistere di preciso queste placche, se non in colonie. Qualcuno pué illuminarmi?
2) Mi č stato inoltre consigliato di valutare se i virioni isolati effettevamente esprimano il peptide, oltre che mediante phage ELISA, mediante Dot blot, altra tecnica che disconosco. Potreste spiegarmi in linea di principio quali informazioni in piu mi da il dot blot rispetto all'ELISA?

Vi ringrazio
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