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Tag   clonaggio    PCR  Aggiungi Tag

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Ari23
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 10 febbraio 2020 : 08:40:59  Mostra Profilo Invia a Ari23 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti,
sto studiando biologia molecolare e non riesco a capire quando è da preferire l'uso di vettori di clonaggio e quando la PCR.

Grazie mille,
Arianna

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1719 Messaggi

Inserito il - 11 febbraio 2020 : 20:22:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
L'uno non è da preferire all'altro. Servono entrambi per il clonaggio.
La PCR amplifica una porzione di DNA, ma finisce lì la sua funzione. Questo frammento di DNA è abbastanza instabile (ha le estremità libere) e non può essere facilmente "introdotto" in una cellula e non ha alcuna funzione (non ci sono siti di trascrizione per esempio)
Se viene però clonato in un vettore diventa più stabile, può essere usato facilmente per trasformare/trasfettare cellule, è economico amplificarlo e si possono aggiungere funzioni (siti di trascrizione/polyA).

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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Ari23
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2020 : 07:59:43  Mostra Profilo Invia a Ari23 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille.
Ma ora ho un altro dubbio.
Nel caso in cui volessi costruirmi una sonda completa che ricopra tutta la sequenza di cDNA di un gene (per andare a identificare tramite Northern-Blot tutti i diversi trascritti) mi conviene utilizzare vettori di clonaggio? In questo caso la PCR non sarebbe una buona scelta vista la lunghezza della sequenza da amplificare giusto?

Citazione:
Messaggio inserito da domi84

L'uno non è da preferire all'altro. Servono entrambi per il clonaggio.
La PCR amplifica una porzione di DNA, ma finisce lì la sua funzione. Questo frammento di DNA è abbastanza instabile (ha le estremità libere) e non può essere facilmente "introdotto" in una cellula e non ha alcuna funzione (non ci sono siti di trascrizione per esempio)
Se viene però clonato in un vettore diventa più stabile, può essere usato facilmente per trasformare/trasfettare cellule, è economico amplificarlo e si possono aggiungere funzioni (siti di trascrizione/polyA).


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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1719 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2020 : 19:42:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Northern Blot...qualcuno li fa ancora???
Non sono giovanissimo, ma non ne ho mai fatto uno e sinceramente non credo si facciano più (e c'è un motivo)
Citazione:

una sonda completa che ricopra tutta la sequenza di cDNA di un gene (per andare a identificare tramite Northern-Blot tutti i diversi trascritti)


Non credo funzioni (se ricordo bene come funziona)...Questa sonda sarebbe in grado di legarsi al gene completo, ma non alle isoforme mancanti di qualche esone a causa di un non completo appaiamento...no?

Citazione:

In questo caso la PCR non sarebbe una buona scelta vista la lunghezza della sequenza da amplificare giusto?

Dipende da quanto è lungo il gene e quanto sono lunghe le isoforme.
Se il gene è lungo 2000bp, e ha 2 altre isoforme da 1500bp e 1000bp io andrei di PCR e vedrei le isoforme su gel di agarosio.

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
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