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Dorina
Nuovo Arrivato
Prov.: Monza
Città: Milano
30 Messaggi |
 Inserito il - 04 giugno 2007 : 17:14:54
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Salve, sono una nuova iscritta e vorrei porre questa domanda:
Che cos'è la membrana di nitrocellulosa o di nylon?Di che cosa si tratta.Cè qualcuno che ha queste informazioni sarei molto gratta.Aspetto risposta al più presto possibile.GRAZIE MILLE.
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Dorina Qehajaj |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
 Inserito il - 04 giugno 2007 : 18:30:51
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ti rispondo per quanto riguarda la membrana di nitrocellulosa: in pratica è un foglio che apparentemente sembra fatto di carta, in realtà si compone per l'appunto di nitrocellulosa ed in lab generalmente è utilizzata per il trasferimento delle proteine dal gel.
Se si mette a contatto un gel di acrilamide con una membrana di nitrocellulosa (o anche di PVDF)e si applica un campo elettrico, le proteine migreranno dal gel alla membrana, la quale può essere prelevata ed incubata con specifici anticorpi. Forse quest'immagine rende l'idea: http://www.fermentas.com/techinfo/electrophoresis/img/blotting.gif |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Dorina
Nuovo Arrivato
Prov.: Monza
Città: Milano
30 Messaggi |
Inserito il - 04 giugno 2007 : 20:33:50
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Ciao Iside,
grazie per avermi risposto, sei stata molto chiara.
avresti ulteriori immagini da mandarmi?
ancora grazie |
Dorina Qehajaj |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 giugno 2007 : 21:10:56
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Ciao Dorina!
Benvenuta sul forum!
Come si utilizzano l'ha già spiegato bene Iside, io aggiungo solo che la maggiore differenza tra membrana di nitrocellulosa e di nylon è che le membrane di nylon sono più resistenti e possono essere riutilizzate più volte il rischio che si strappino (cosa che succede con la nitrocellulosa) e presentano una capacità di legame più alta rispetto alla nitrocellulosa.
Entrambe possono essere di porosità diverse e si scelgono in base all'uso che si vuole fare: blot di proteine, DNA o RNA.
Come diceva Iside ci sono anche quelle di PVDF che sono molto usate soprattutto per le proteine e hanno una capacità di legame superiore alla nitrocellulosa.
Che tipo di immagini hai bisogno??
Ad esempio se fai una ricerca per "blotting" in google immagini ne trovi tantissime:
Immagini Boltting |
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Dorina
Nuovo Arrivato
Prov.: Monza
Città: Milano
30 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2007 : 00:20:02
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Ciao GFPina,
grazie per l'aiuto,ho anche visitato il sito che mi hai indicato.
Una volta che le proteine si attaccano alla membrana come bisogna procedere?
Perchè bisogna incubarla con degli anticorpi?
Qual'è il fine di questo procedimento?
Io so che la membrana di nitrocellulosa viene utilizzata per estrarre il DNA.
Perciò più informazioni ricevo meglio è.
aiuto |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2007 : 03:08:29
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Gli anticorpi li usi solo nel caso del Western blotting, cioè quando vuoi analizzare le proteine in un certo campione.
Dopo aver legato le proteine alla membrana, la fai incubare con un anticorpo specifico per la tua proteina di interesse. Questo anticorpo deve essere marcato in qualche modo, cosicchè puoi vedere se la tua proteina è presente o meno.
Se invece stai analizzando DNA o RNA (attenzione la membrana serve solo per l'analisi, non per l'estrazione!) non usi gli anticorpi ma usi una sonda di DNA o RNA marcata ad esempio con nucleotidi radioattivi. La sonda dovrà avere sequenza complementare al tuo DNA o RNA di interesse in modo che si leghi specificamente a quello. |
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2009 : 13:18:31
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Carissimi amici,
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Dopo aver indotto, purificato e concentrato la mia proteina di interesse, mi accingo a fare un Western Blot e visto che oggi è venerdì, non vorrei fare tardi in laboratorio, come l'altro giorno...
...perciò mi chiedo e vi chiedo se è possibile in 4 ore trasferire le proteine nel sandwich ad 1,2 A di voltaggio...
...io di solito per un ottimo trasferimento lo lascio in corrente ower-night...
Poi un altra vi chiedo un altra cosa che ho letto su un protocollo della QIagen;
che senso ha immergere la Nitro oppure la Polyvinylidene fluoride (PVDF) in metanolo e poi lavarla con H2O distillata prima di fare il sandwich se poi devo immergerla in sandwich nel tampone fosfato
Grazie a tutti per la collaborazione..
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www.tlbspazio.it
Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi |
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mikroula
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 13 febbraio 2009 : 15:13:32
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| Aureus io procedevo a trasferire per 45 minuti a 250 mA, ma dipende dal peso della proteina. Se è troppo pesante vai a 400 mA per lo stesso tempo. Poi la membrana prima del trasferimento la mettevo immersa nel buffer di trasferimento |
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Ricciola
Nuovo Arrivato
38 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2009 : 12:45:55
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Ciao Aureus,
scusa per il ritardo, spero di esserti utile lo stesso.
Io il trasferimento lo faccio a 60V per 2 ore, ma c'è chi lo fa anche a 100V per 2 ore; francamente il trasferimento o/n mi giunge nuovo, e temo che scaldi troppo....
Solitamente nel tampone di trasferimento viene aggiunto metanolo, che aiuta il trasferimento delle proteine più grandi, e le membrane di PVDF hanno bisogno di essere equilibrate qualche secondo prima.
ciao! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2009 : 23:45:08
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Citazione:
Messaggio inserito da Ricciola
... francamente il trasferimento o/n mi giunge nuovo, e temo che scaldi troppo....
Beh veramente moltissimi usano il trasferimento o.n., in genere è più efficiente e comunque viene eseguito a 4°C quindi non si scalda troppo!
Citazione:
Messaggio inserito da Ricciola
Solitamente nel tampone di trasferimento viene aggiunto metanolo, che aiuta il trasferimento delle proteine più grandi,
E' esattamente il contrario!!!
Il metanolo fa dissociare l'SDS dalle proteine e denatura le proteine ad alto peso molecolare quindi rende più difficile il passaggio di proteine grandi! Al contrario invece l'SDS aiuta il trasferimento di proteine ad alto peso molecolare!
Il ruolo del metanolo è invece importante nel legame tra proteine e membrana, in quanto aumenta questo legame, al contrario dell'SDS che invece può interferire con questo legame.
Citazione:
Messaggio inserito da Ricciola
e le membrane di PVDF hanno bisogno di essere equilibrate qualche secondo prima.
Questo è vero, vanno immerse in metanolo prima dell'utilizzo per essere attivate, in genere le membrane di PVDF sono idrofobe e l'attivazione in metanolo le rende più idrofile.
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membrana di nitrocellulosa
Didattica
