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 Colonnine per miniprep - Infrangerne i limiti?
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Manz
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Manz-64
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Inserito il - 13 giugno 2007 : 16:10:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Manz Invia a Manz un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Un festoso saluto a tutti gli astanti.

Qualcuno fra voi mi conosce per essere il necroletttico direttore di una gioiosa rivista online dal serioso nome di Journal of Molecular Proctology. Avevo presentato i contenuti dell'ultimo numero proprio in questo forum, qui.

http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=3371

Trovandomi nella scrittura di un articolo per il prossimo numero, mi sono imbattuto in qualcosa che mi piacerebbe prima affrontare "in sede ristretta" per evitare di incorrere in casini di qualsiasi tipo.

La faccenda è la seguente. In laboratorio utilizzo un kit per le miniprep, prodotto commercialmente da una ditta che chiameremo col nome fittizio di "Salcavolo".
Il kit consiste di colonnine di una membrana di materiale a me ignoto, e una serie di soluzioni da utilizzare con i pellet di batteri prima e le suddette colonnine poi, sempre prodotte dalla Salcavolo e la cui composizione non è indicata.
Dapprima ho provato a riutilizzare le colonnine con i reagenti che venivano forniti dal kit stesso con ottimi risultati per almeno 10 miniprep (con "almeno 10" intendo che nn ho fatto ulteriori prove, per sfinimento di pazienza e non per deterioramente della resa). Poi, ho provato a preparare io delle soluzioni, basandomi su
- protocolli per miniprep del tipo "STET" che ho trovato su internet
- protocolli per midiprep non commerciali senza colonnine/membrane che ho trovato con google
- MSDS liberamente disponibili
- pura fortuna
e dopo un po' di sbattimento sono riuscito ad ottenere soluzioni che mi permettessero di ottenere risultati paragonabili (attenzione bene alla terminologia) a quelli ottenibili col kit di partenza.

Ora ho due questioni:

1) Ho scritto l'articolo in forma "impersonale", senza far riferimento alla Salcavolo in qualsiasi modo e insistendo sul fatto che le mie soluzioni non sono "analoghi", ma piuttosto qualcosa di simile a ciò che le cartucce compatibili x una stampante lo sono rispetto a quelle originali.
--> Secondo voi è possibile pubblicare un metodo che permette di "estendere" la vita lavorativa di un kit (che non viene citato)? Ossia di fornire un utilizzo alternativo di un "mezzo fisico" da voi regolarmente acquistato e per cui ci (credo) potete fare il cappero che vi pare?

2) Si può pubblicare l'articolo citando espressamente la Salcavolo, facendo ben presente come le soluzioni da me proposte NON siano "analoghi" o "le stesse" e non forniscano risultati "uguali"??

Attendo le vostre opinioni,

M

Come dici? Ma certo, che sono il prescelto! Non penserai mica che fosse quello stupido bambino biondo che spostava gli oggetti col pensiero, e che ha traslocato da casa questa mattina?

http://sabaroth.altervista.org/JMP/ - Journal of Molecular Proctology

chick80
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DNA

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Inserito il - 13 giugno 2007 : 22:46:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao bello! Non ti fai più sentire eh? (non tirare fuori scuse quali: 'ma nemmeno tu ti sei fatto sentire...')

La risposta credo sia molto semplice, qualunque azienda ti garantisce sempre e comunque limiti cautelativi, perchè così sono sempre sicuri che i tuoi esperimenti funzionino nelle condizioni da loro indicate. E' un po' come la data di scadenza sui prodotti, è sempre indietro di un tot di giorni.

Quindi, in sostanza io credo non ci siano problemi, se metti le solite frasi tipo: "questo metodo non è confermato da Salcavolo che non ne garantisce i risultati. Use at your own risk. May contain traces of nuts"....

La mia domanda è: ma puoi comprare le colonnine senza soluzioni? Perchè altrimenti non ha senso sbattersi a fare soluzioni se loro te le danno già pronte...

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Manz
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Manz-64

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Inserito il - 14 giugno 2007 : 12:36:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Manz Invia a Manz un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No, nn le vendono senza soluzioni. E nemmeno vendono soluzioni senza colonnine! Ci sono per esempio alcune ditte che includono fra i loro kit un "cleaning buffer" che consente un limitato riutilizzo delle colonne (naturalmente con tutte le considerazioni del caso che nn ho preso in considerazione in quanto non argomento di questo topic, ma si cui si può naturalmente discutere), ma naturalmente "loro" puntano a vendere il tutto e spacciartelo come essenziale.

Grazie per la tua opinione!

***

Citazione:
Ciao bello! Non ti fai più sentire eh? (non tirare fuori scuse quali: 'ma nemmeno tu ti sei fatto sentire...')


Non lo farò allora Ti ricorderò però che tu hai il mio indirizzo MSN e che qualcuno dei miei bambini (PC/mac) è sempre online...
Se nn ce l'hai, PMami.

Come dici? Ma certo, che sono il prescelto! Non penserai mica che fosse quello stupido bambino biondo che spostava gli oggetti col pensiero, e che ha traslocato da casa questa mattina?

http://sabaroth.altervista.org/JMP/ - Journal of Molecular Proctology
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GFPina
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GFPina

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Inserito il - 14 giugno 2007 : 20:02:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da chick80

La mia domanda è: ma puoi comprare le colonnine senza soluzioni? Perchè altrimenti non ha senso sbattersi a fare soluzioni se loro te le danno già pronte...


Beh ha senso se vuoi riutilizzare le colonnine più volte visto che le soluzioni anche se ne mettono in eccesso prima o poi finiscono.

Ma quello che mi chiedo è: come la mettiamo con la purezza di quello che estrai riutilizzando la colonnina?
Hai riutilizzato il pellet dello stesso clone tutte le volte sulla stessa colonnina? Altimenti penso ci sia pericolo di cross-contaminazione!

Per quanto riguarda "cosa si può dire" non so... ma penso che chick abbia ragione!

Attendo con ansia di leggere l'articolo... intanto ti faccio i complimenti per la rivista! Geniale!!!
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Manz
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Manz-64

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27 Messaggi

Inserito il - 14 giugno 2007 : 23:34:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Manz Invia a Manz un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Ma quello che mi chiedo è: come la mettiamo con la purezza di quello che estrai riutilizzando la colonnina?
Hai riutilizzato il pellet dello stesso clone tutte le volte sulla stessa colonnina? Altimenti penso ci sia pericolo di cross-contaminazione!



GFPina, ti ringrazio per aver sollevato la questione. Naturalmente sul JMP mica stiamo a grattarci , e naturalmente la cosa era già stata presa in considerazione:

Citazione:
Ci sono per esempio alcune ditte che includono fra i loro kit un "cleaning buffer" che consente un limitato riutilizzo delle colonne (naturalmente con tutte le considerazioni del caso che nn ho preso in considerazione in quanto non argomento di questo topic, ma si cui si può naturalmente discutere)


Ho sviscerato l'argomento nell'articolo (che naturalmente nn avete ancora letto ^_^), e se la cosa riscuote interesse inviterei ad aprire un altro thread e mantenere questo più sulle "legal issues" della faccenda.

Aggiungo il tuo parere a quello del buon chick80 e inizio a trovarmi un avvocato molto economico!

Come dici? Ma certo, che sono il prescelto! Non penserai mica che fosse quello stupido bambino biondo che spostava gli oggetti col pensiero, e che ha traslocato da casa questa mattina?

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RM
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Inserito il - 15 giugno 2007 : 18:20:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RM Invia a RM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh...c'è un articolo della Promega nel quale dimostrano chiaramente che la famosa "Q solution" della Qiagen non è altro che "normalissima" betaina 5M,che si usa da anni come additivo per PCR...se non gli hanno fatto causa loro...

http://www.promega.com/pnotes/65/6921_27/6921_27_core.pdf
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RM
Nuovo Arrivato



115 Messaggi

Inserito il - 15 giugno 2007 : 18:28:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RM Invia a RM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ovviamente non specificando mai il nome della ditta...
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GFPina
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GFPina

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Inserito il - 15 giugno 2007 : 19:58:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Manz

GFPina, ti ringrazio per aver sollevato la questione. Naturalmente sul JMP mica stiamo a grattarci , e naturalmente la cosa era già stata presa in considerazione:
....
Ho sviscerato l'argomento nell'articolo (che naturalmente nn avete ancora letto ^_^), e se la cosa riscuote interesse inviterei ad aprire un altro thread e mantenere questo più sulle "legal issues" della faccenda.

Beh allora non ho niente da ridire... aspetto di leggermi l'articolo!!!


Citazione:
Messaggio inserito da Manz
Aggiungo il tuo parere a quello del buon chick80 e inizio a trovarmi un avvocato molto economico!

Va beh allora forse sarà meglio che lo cerchiamo anche noi... non si sa mai!!!

Se riesco ad avere il parere di qualche avvocato amico di amici... ti faccio sapere!!!
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chick80
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DNA

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Inserito il - 15 giugno 2007 : 23:34:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Manz, se vuoi un avvocato ti ricordo che conosci un uomo senza una spalla (ok, questa la possono capire solo in pochi, quindi se non ha senso per voi ignoratela )

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zio
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Inserito il - 16 giugno 2007 : 07:58:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zio Invia a zio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
la famosa "Q solution" della Qiagen non è altro che "normalissima" betaina 5M,

grazie RM, da me qualcuno si chiedeva cosa fosse quella
"l'acqua di Lurdes"

zio
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zio
Utente Junior


Città: Napoli (IRAQ)


120 Messaggi

Inserito il - 16 giugno 2007 : 08:16:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zio Invia a zio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Ma quello che mi chiedo è: come la mettiamo con la purezza di quello che estrai riutilizzando la colonnina?
Hai riutilizzato il pellet dello stesso clone tutte le volte sulla stessa colonnina? Altimenti penso ci sia pericolo di cross-contaminazione!


boh silvia

vedi chick, nella diagnostica, questo è impensabile. lo sò che l'argomento di manz è provocatorio ,ma figurati se solo accenno una cosa del genere nel mio lab,
altro che avvocato: mi fucilano!

zio
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chick80
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DNA

Città: Edinburgh


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Inserito il - 16 giugno 2007 : 09:05:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh, io anche fuori dalla diagnostica non sarei troppo convinto però...

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Manz
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Manz-64

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Inserito il - 16 giugno 2007 : 15:03:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Manz Invia a Manz un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Manz, se vuoi un avvocato ti ricordo che conosci un uomo senza una spalla


Rispondo a chick80: il buon Reshouldered è naturalmente stato interpellato, ma naturalmente il tutto è "pending", e siamo ancora tutti in attesa, oltre che del ritorno del Salvatore, anche del parere legale del suo superfratello! :)

Citazione:
Beh, io anche fuori dalla diagnostica non sarei troppo convinto però...


D'accordo, vi butto un'idea. Immaginate di aver 150 cloni (parlo di batteri su una petri) che non potete screenare con una PCR su colonia per vari motivi. Voi li crescete singolarmente, poi ne salvate una piccola aliquota (in eppendorf in frigo o fate un glicerolato, o roba del genere) e procedete a fare le miniprep con delle colonnine usate. Potete tranquillamente dividerli in lotti da 24 (almeno, il numero di buchi delle nostre centrifughe) e riusare tranquillamente le colonnine per tutti quanti: una volta trovato il/i clone/i che vi piacciono dopo una o più analisi di restrizione, andate a ripescare e crescere solo quei cloni che sono venuti come dovevano (pescandoli dai glicerolati o dalle provettine nel frigo), e poi a questo punto usare colonnine nuove, per purificare i plasmidi. Con un notevole risparmio di colonnine "pulite"...

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chick80
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Inserito il - 16 giugno 2007 : 15:39:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok, questo ha senso in effetti.
Non lavoro con batteriacci quindi non avevo pensato a una situazione del genere :)

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RM
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Inserito il - 17 giugno 2007 : 12:57:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RM Invia a RM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io per non sprecare colonnine per l'analisi di restrizione dei cloni, semplicemente invece di caricarlo sulla colonna, precipito con isopropanolo il sopranatante, ottenuto dalla centrifugata post-lisi (quella col P3 per capirci), risospendo e restringo. Poi una volta identificato il clone giusto, te lo purifichi più accuratamente con la colonna, come suggerisci. Immagino comunque che anche il tuo metodo sia applicabile perfettamente.
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Manz
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Manz-64

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Inserito il - 17 giugno 2007 : 13:10:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Manz Invia a Manz un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
[...] precipito con isopropanolo il sopranatante, ottenuto dalla centrifugata post-lisi (quella col P3 per capirci)


Sia messo agli atti che io MAI ho detto "Qiagen", vostro onore!

Ottimo trucco anche la precipitazione del surnatante, x nn buttare colonne!

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RM
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Inserito il - 17 giugno 2007 : 13:30:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RM Invia a RM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
eh eh..la giuria ne terrà conto...

Comunque sembra ci sia un precedente...

http://www.biotechniques.com/article.asp?id=112327



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Manz
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Manz-64

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Inserito il - 17 giugno 2007 : 14:19:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Manz Invia a Manz un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sono allibito dalla puntualità della segnalazione. Devo ammettere la mia colpa nell'aver cercato solamente con google, e non in Pubmed, possibili "ortologhi" di quanto stavo proponendo.
Credo che il (meraviglioso) articolo citato da RM risponda a molte delle mie iniziali domande.

Fortunatamente, il testo si focalizza sul problema delle "carryover contaminations", argomento di cui io sicuramente non mi facevo propugnatore (fate riferimento all'utilizzo che vi ho indicato poco sopra), e non fornisce informazioni su come fare a continuare ad utilizzare le colonnine una volta terminati i reagenti:

Citazione:
Commercial kits supply limited volume of the buffers required for column regeneration. However, the composition of the buffers is provided in several technical brochures, and a laboratory with adequate molecular biology expertise should be able to make its own reagents


Modificherò sicuramente il mio testo con il contributo di questa referenza. Grazie mille!!

Come dici? Ma certo, che sono il prescelto! Non penserai mica che fosse quello stupido bambino biondo che spostava gli oggetti col pensiero, e che ha traslocato da casa questa mattina?

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Patrizio
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mago

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Inserito il - 17 maggio 2008 : 17:37:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho riesumato questo topic perche' sarei interessato a sapere se alla fine l articolo citato da Manz e' stato fatto o meno !


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Patrizio
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mago

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Inserito il - 14 luglio 2008 : 23:13:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
VOLEVO DIRVI CHE IL RICICLO DELLE COLONNINE FUNZIONAA!!!
l HO PROVATO SU DEI CLONI CHE AVEVO,L UNICA COSA E CHE ..... ne ho provato solo una riciclata ed e' andata bene,e' venuta fuori una bella bandozza e poi ho fatto un controllo senza mettere DNA e non e' venuto niente fuori,cmq....provateci anche voi
cosi' le vostre soluzioni che rimangono a "litri" non verranno piu' buttate

anche se onestamente,il dubbio mi rimane per le altre

However this is the article
http://www.biotechniques.com/article.asp?id=112327


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GFPina
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GFPina

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Inserito il - 15 luglio 2008 : 01:38:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio

VOLEVO DIRVI CHE IL RICICLO DELLE COLONNINE FUNZIONAA!!!
l HO PROVATO SU DEI CLONI CHE AVEVO,L UNICA COSA E CHE ..... ne ho provato solo una riciclata ed e' andata bene,e' venuta fuori una bella bandozza e poi ho fatto un controllo senza mettere DNA e non e' venuto niente fuori,cmq....provateci anche voi
cosi' le vostre soluzioni che rimangono a "litri" non verranno piu' buttate

anche se onestamente,il dubbio mi rimane per le altre

However this is the article
http://www.biotechniques.com/article.asp?id=112327



e le colonnine che sono avanzate a me di cui non so cosa farmene???
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Patrizio
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mago

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Inserito il - 15 luglio 2008 : 08:17:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
come fanno ad avanzarti colonnine miniprep,cioe' rimangono piu' della meta' delle soluzioni seguendo il protocollo alla lettera...se provi a fare un po' di economia non ti dico.... parlo dei kit invitrogen


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GFPina
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GFPina

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Inserito il - 15 luglio 2008 : 09:33:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio

come fanno ad avanzarti colonnine miniprep,cioe' rimangono piu' della meta' delle soluzioni

Semplice...mi sono avanzate anche quelle!!!
Ma a differenza delle soluzioni le colonnine non scadono e quindi vanno sprecate!!!
Se vuoi te le mando!
Citazione:
.... parlo dei kit invitrogen

Anche con gli altri se è per questo!

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Patrizio
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mago

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Inserito il - 15 luglio 2008 : 09:50:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
mha...strano,ce ne saranno appena 50,
mystery


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GFPina
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GFPina

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Inserito il - 15 luglio 2008 : 09:56:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio

mha...strano,ce ne saranno appena 50,
mystery

Patrì!!! Hai bisogno di caffè stamattina???
Mi sono avanzate sia le colonnine che le soluzioni!!!
Si erano 50, ne ho usate una quarantina e me ne sono avanzate una decina! Le ultime estrazioni hanno iniziato a venire da schifo! Le soluzioni sono ormai vecchie, adesso utilizzo un altro kit molto più comodo e veloce... MORALE: ho lì delle soluzioni scadute e delle colonnine che sarebbero ancora buone e non so che farmene!!!

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Patrizio
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mago

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Inserito il - 15 luglio 2008 : 11:20:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
paghi tu?
non avevo letto anche quelle
e cmq,e' ovvio che il mio post si riferiva per chi come me finisce le colonnine e che lavora...


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