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moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
 Inserito il - 23 giugno 2007 : 07:45:55
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Ciao a tutti.
vengo da una settimana un po' persa a causa di problemi con un gel di poliacrilammide denaturante.
Mi spiego meglio.
Una parte degli esperimenti che porto avanti in lab riguarda l'utilizzo di un substrato di DNA a doppio filamento con uno dei due filamenti marcati al 5' radioattivamente.
Il Dna( dopo una reazione) devo correrlo, dopo averlo denaturato, su gel di poliacrilammide al 20%, con urea 7M.
I vetri che utilizzo sono molto spessi perchè evono sostenere alte temperature( mando la corsa a più di 1000 Volt), quindi con degli spacer e delle mollette mi "costruisco il tutto per colare il gel.
Il gel polimerizza bene ma al momento di togliere il pettine, si rompono tutti i pozzetti.
Ho fatto decine di questi gel e non capisco perchè, alle volte, per giorni non riesco ad avere un gel decente.
Questa settimana l'ho colato ben 8 volte, tutte le volte quasi tuti i pozzetti venivano via con il pettina.
le ho provate tutte, ho rifatto l'APS fresco, ho cambiato lo stock di acrilammide, ho provato ad aspettare tempi più lunghi prima di togliere il pettine, ho anche pensato potesse essere la temperatura perchèin lab abbiamo l'aria condizionata e quindi ho portato l'apparato in un lab a fianco senza ...insomma secondo voi quale potrebbe essere il problema?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 23 giugno 2007 : 08:40:35
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Immagino il gel sia verticale. Prova a togliere il pettine mettendo il gel in orizzontale, a volte aiuta. Puoi anche immergere la parte col pettine nel buffer di corsa prima di toglierlo, solitamente lo fa scivolare via più facilmente. Inoltre assicurati di togliere il pettine parallelamente al gel e non più velocemente da una parte o dall'altra.
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moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 23 giugno 2007 : 08:58:50
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Immagino il gel sia verticale. Prova a togliere il pettine mettendo il gel in orizzontale, a volte aiuta. Puoi anche immergere la parte col pettine nel buffer di corsa prima di toglierlo, solitamente lo fa scivolare via più facilmente. Inoltre assicurati di togliere il pettine parallelamente al gel e non più velocemente da una parte o dall'altra.
Sì il gel è verticale e tolgo sempre il pettine in orizzontale...
Comunque grazie del consiglio, proverò ad immergere il gel nel tampone primadi togliere il pettine...
Altri consigli o idee? |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 23 giugno 2007 : 12:59:33
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| oltre al consiglio di chick di immeregere il gel nel tampone, puoi provare a sfilare il pettine partendo da uno dei due lati e molto lentamente. Magari così non si rompono i pozzetti. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 23 giugno 2007 : 13:21:52
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Mah, potrebbe essere un problema di pettine?
Magari ne hai qualcuno che è storto e rovinato!
Questo spiegherebbe perche certe volte hai questo problema e altre volte no! |
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aitan3
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
71 Messaggi |
Inserito il - 23 giugno 2007 : 15:14:51
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in alternativa per consentire una migliore polimerizzazione del gel, potresti anche prepararlo un giorno prima della corsa e poi conservarlo a 4°C ponendo un po di carta impregnata di acqua sulla lastra (in particolare un po sul pettine e un po sulla lastra) in questo modo sarai certo della polimerizzazione ed al contempo stesso sarà abbastanza semplice togliere il pettine. facci sapere quale metodo hai utilizzato e come è andata.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 23 giugno 2007 : 20:35:15
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A parte il fatto che in queste ultime settimane non ti dico che schifo di gel di poliacrilamide stanno venendo anche a me!
Sarà il caldo???
Comunque io prima di colare il gel passo tutto (vetri e pettinini) con alcool, i pettinini sopratutto tra un dentino e l'altro devono essere ben puliti altrimenti può attaccarsi il gel e si rompono i pozzetti. Come dice valia controlla anche che i pettinini non siano rovinati.
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moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2007 : 13:07:11
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grazie a tutti, ho lasciato perdere orami il substrato marcato sarà già decaduto della metà della metà...riinizierò gli esperimenti con il radioattivo dopo la mia laurea, la prox settimana quando sarò un po' più presente mentalmente!
Terrò a memoria i vostri ottimi consigli! |
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Gel denaturante di urea
Didattica
