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gianfritz
Nuovo Arrivato

3 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2007 : 16:10:27

Salve ragazzi.

Mi sono deciso a provare lo stripping di un filtro di Nitrocell.

Ho utilizzato la sol di stripping con Mercaptoetanolo SDS in PBS/TBS (la conposizione precisa � quella che si trova sulla sezione protocolli del forum)

beh... l'ho fatta sia a TA che a 50 �C per 30 minuti, addirittura ho lasciato tutto per 48 ore...
Risultato il filtro non si � per nulla decolorato

e il sucessivo sviluppo (AgI gi� testato AbII AP cj) non ha dato nessuna banda

Voi avete provato a strippare filtri sviluppati con AP con risultati positivi?

biomol
Nuovo Arrivato

65 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2007 : 17:15:37

ciao.io non ho mai strippato con AP...ma quando l'ho fatto per il mio anticorpo e mi � successo si non avere nulla � perche non avevo fatto lavare bene il filtro dopo lo stripping e quindi il beta merc avevo inibito la reazione con il secondo anticorpo...spero di ti possa essere di aiuto..
in bocca al lupo

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2007 : 22:41:34

Lo stripping ti diminuisce l'efficienza del secondo WB. Quindi conviene fare prima il blotting per la proteina meno espressa e poi per quella pi� espressa. Inoltre ricorda che non puoi confrontare quantitativamente i due blotting.

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gianfritz
Nuovo Arrivato

3 Messaggi

Inserito il - 09 luglio 2007 : 10:04:14

Uhmm... la prova che ho fatto era con un ABI per HSP70... ed ha un'affinit� bestiale, figuratevi che ottengo le bande anche solo bagnando per 3 secondi (del tutto inutile tenere il filtro con il I per 1h!!)

Dopo lo strip ho risviluppato per lo stesso ABI con la stessa procedura sin dal blocking, ma nulla.

Ci devo riprovare..

grazie per i consigli.... a presto.