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Balsamo del Canadà
Nuovo Arrivato
Prov.: Verbano-Cusio-Ossola
Città: Verbania
97 Messaggi |
 Inserito il - 05 luglio 2007 : 15:16:31
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Citazione:
Messaggio inserito da chiaretta
Ragazzi vi pongo qlc domandina semplice semplice...:
- qual è la diffenza tra PCR quantitativa e semiquantitativa?
- cos'è il background in una real time PCR?
- come si ottiene dal ciclo di soglia il valore della quantità iniziale di DNA?
grazie grazie grazie 
Allora, se non mi sbaglio:
1.La pcr quantitativa ti permette di stabilire in modo assoluto la quantità di DNA presente nel tuo campione originario. Cioè arrivare ad una concentrazione precisa. Quella semiquantitativa mi sembra invece che utilizzi un punto di riferimento. Tipo un gene che sia espresso costitutivamente (un housekeeping), cioè noi otteniamo un dato quantitativo ma sempre relativo, tipo quante volte il gene di interesse è espresso in più rispetto all'housekeeping scelto. Quindi usando sempre lo stesso housekeeping come riferimento in campioni diversi, si può stabilire l'espressione differenziale di un gene di interesse.
2.Dipende cosa intendi per background. Se stai parlando delle fluorescenza allora si riferisce al rumore di fondo..cioè che livello basale aspecifico di segnale arriva al tuo rilevatore. Questo se alto compromette ovviamente le tue quantificazioni. Come background però io spesso intendevo anche il livello di espressione basale dell'housekeeping. Quello che tieni per "normalizzare" i dati tra reazioni diverse. In pratica per poter fare dei confronti tra dati diversi si normalizza rispetto ad un fattore che dovrebbe essere sempre costante.. come l'espressione di un rRNA.
3. Per poter stabilire la quantità di DNA dal ciclo soglia calcolato hai bisogno di una retta di calibratura. Su campioni a quantità nota del prodotto di interesse fai la pcr real time e segni i tuoi cicli soglia. Poi fai una retta tra le quantità e i cicli trovati.. alla fine inserisci il valore di Ciclo dell'incognita e il gioco è fatto.
Spero di non aver scritto stupidate...la PCR real time incomincio ad averla fatta troppo tempo fa!
Ciao ciao |
-B.del C.- |
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Inserito il - 05 luglio 2007 : 13:59:47
