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Trains
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
 Inserito il - 10 luglio 2007 : 19:11:31
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Ciao, sto studiando Biochimica Applicata per CTF e mi è venuto qualche dubbio  , voi saprete sicuramente aiutarmi!
- nel testo mi dice che la resa della purificazione è data da unità di enzima nella frazione/unità di enzima nella preparazione iniziale, poi in una tabella me la indica come attività totale della frazione/attività totale dell’omogenato. Quindi mi chiedo: unità ed attività sono la stessa cosa? Perchè nel caso mi chiedevo se dire attività specifica fosse uguale a dire unità di attività enzimatica.
- La Dialisi e l'ultrafiltrazione a che stadio della purificazione generalmente si usano?
- Gel filtration: per conoscere il PM delle molecole che separo faccio una retta di taratura con il volume di eluizione di molecole a PM noto (in y logMr in x Ve). Ma se voglio utilizzare la stessa retta di taratura su un'altra colonna che ha la stessa fase stazionaria ma dimensioni diverse come faccio?
Scusate se mi sono dilungata molto ! Vi ringrazio per l'attenzione
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Endorfina
Nuovo Arrivato
Città: Catania
12 Messaggi |
Inserito il - 11 luglio 2007 : 17:12:03
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conosco la tua condizione: materia stupenda ma se nn si associa a una pratica in laboratorio diventa la +noiosa!allora:
1)la resa della purificazione è: unità di enzima della frazione/unità di enzima nella preparazione iniziale. Mentre quello che tu hai trovato in tabella è il GRADO di purificazione, cioè attività specifica della frazione/attività specifica iniziale.
la differenza tra resa e grado di purificazione è che la RESA dà le quantità di enzima presenti prima e dopo la purificazione,il GRADO considera le variazioni di attività specifica nel corso della purificazione.Infatti potrebbe accadere che si abbia un aumento della attività specifica nella purificazione ma in realtà una parte di proteina che si sta purificando si è persa strada facendo..
la quantità di enzima presente in una frazione viene espressa in unità di attività basandosi sulla velocità della reazione catalizzata dall'enzima.
2)credo si usino nei passaggi preliminari di separazione dai componenti cellulari..
3)le colonne di gel filtrazione sono di norma +lunghe delle altre..cmq credo che esistano già delle rette di taratura per quelle in uso comune,quella relazione vale lo stesso in quanto logMr è in rapporto quasi lineare con Ve.
Spero di essere stata chiara!  |
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Trains
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 11 luglio 2007 : 19:54:48
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Citazione:
Messaggio inserito da Endorfina
conosco la tua condizione: materia stupenda ma se nn si associa a una pratica in laboratorio diventa la +noiosa!allora:
Noiosa per fortuna no, ma che non sia facile capire tutto sì, per fortuna che c'è internet con lavori e foto varie...
Sì ti ringrazio tanto hai dato una rispota ai miei dubbi...se posso approfittare della tuo tempo ti chiedo qualche altra cosa:
- la linearità di cui parli si perde quandoo si esce dal range di frazionamento della colonna giusto?
- sull'elettroforesi PAGE: ci sono varie tipologie di celle elettroforetiche verticali? cioè, il tampone, che poi è quello di corsa che passa nel gel, è sempre solo presente in un buffer superiore ed in uno inferiore o il gel può essere immerso, sempre tra le lastrine, completamente nel tampone?
- SDS-page discontinuo: vorrei vedere se ho capito bene, magari è utile pure ad altri:
i 2/3 inferiori dello spazio tra le lastrine è occupato dal runnig gel. Questo è in PAGE 15% a pH 8,8 derivante dal tampone di TRIS-HCl con la molarità opportuna. Nel 1/3 superiore c'è lo stacking gel, preparazione identica se non fosse per le maglie più larghe, 5%,e pH 6,8. I campioni li carichiamo in mix col tampone TRIS-HCl a pH 6,8 , i denaturanti vari, il tracciante, e glicerolo per aumentare la densità. Poi i buffers. Nel superiore il tampone per la corsa di Tris Glicina + SDS ma a pH 8,3. In quello inferiore mettiamo la medesima mix?
Ora, lo schicciamento della banda del campione: deriva dalla divera mobilità elettrofoetica di Cl- Gly e Proteine, però non ho ben capito come. In più ora mi sorge un dubbio atroce ed un po' imbarazzante, ma il tampone passa nel gel? quello del buffer superiore.
Grazie infinite
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Endorfina
Nuovo Arrivato
Città: Catania
12 Messaggi |
Inserito il - 13 luglio 2007 : 20:00:50
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-la relazione logMr/Kd (o Ve) è lineare per un ampio intervallo di masse molecolari relative,ovviamente quelle troppo grandi verrano escluse dalla colonna e avranno Kd=0 e quelle di dimensioni tali da accedere completamente ai pori della colonna avranno Kd=1. di solito le proteine da separare in una data colonna hanno Kd compresi tra 0 e 1.il range di frazionamento dipende dal tipo di gel e dalla grandezza dei pori voluta.
-SDS PAGE: il tampone di corsa e quello della resolving (la porzione inferiore del gel) hanno composizione e pH molto simili,mentre la stacking (parte superiore del gel) ha concentrazione e pH diversi del tampone perchè ha la finalità di impaccare il campione.
-il tampone usato per preparare il gel e il tampone di corsa,inserito nella vaschetta elettroforetica,per forza di cose dovranno entrambi avere composizione simile,visto che quando si applica la corrente il running buffer permeerà il gel. però si riempe la vaschetta alla fine, prima si prepara il gel e lo si lascia solidificare tra i vetrini...quindi TRIS, glicina e SDS penetreranno nel gel interamente,sia nella parte superiore che nella inferiore,senza interferire con la separazione.
per quanto riguarda l'impaccamento,è una questione che anche a me risultò difficile comprendere...in pratica la mobilità elettroforetica è Gly< complessi proteine-SDS < Cl- (gli ioni glicinato non sono completamente ionizzati). quando si applica la corrente,tutti gli ioni dovranno muoversi alla stessa velocità, gli ioni glicinato per muoversi alla stessa velocità di Cl- dovranno quindi porsi in una regione di campo elettrico a intensità maggiore (l'intensità del campo elettrico è inversamente proporzionale alla concentrazione). Per questo motivo le tre specie si disporranno in modo che [Cl-]>[prot-SDS]>[glicinato], quindi in bande sottili,una sull'altra.
quando gli ioni glicinato arrivano al gel inferiore per effetto del campo elettrico,saranno completamente carichi per il pH maggiore (8.8),la loro mobilità aumenta e si muoveranno con i Cl- +velocemente dei complessi proteine-SDS,che verranno lasciati separare secondo la loro diversa mobilità elettroforetica.
gli ioni del tampone del gel superiore passano quindi nel gel sottostante: il campo elettrico fa muovere infatti TUTTI gli ioni presenti nel gel.
Ah,in laboratorio di solito non immergiamo completamente il gel nel running buffer..facciamo arrivare il livello diciamo quasi all'orlo dei vetrini,credo per preservare i campioni nei pozzetti e cmq perchè non è necessario.
BUONO STUDIO
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princy
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9 Messaggi |
Inserito il - 21 agosto 2009 : 21:09:07
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| Scusate l'ignoranza, ma che bisogno c'è del cloro e del glicinato? Le proteine non riescono a separarsi da sole per effetto del campo elettrico? |
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