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atreliu
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Inserito il - 11 settembre 2003 : 11:51:32
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Riporto da una email di Enzo 
quote:
ho appena iniziato la mia tesi ed ho subito un problema ad amplificare un gene: F41.
è gene responsabile di poteina antigenica che mi interessa, è piuttosto lungo, circa 900bp, devo amplificarlo da DNA genomico dato che nn ce l'ho clonato in plasmide.. esiste già in commercio, ma costa molto, probab perchè è difficile da clonare.. mi sai dare qlc consiglio??
ciao
--enzo--
A cui ho risposto con...
Bhè,
per amplificare la via attraverso i plasmidi è certamente la più facile. Ma si potrebbe anche pensare ad una PCR.
In particolar modo disegnerei i primer in modo tale da avere anche delle ali, estremità che non si appaiono (ma son 4 basi,quindi nn cra molto problema, se il primer è un filo più lungo edl solito), nelle quali presente un sito di restrizione.
Dopo aver effettuato la PCR, posso eliminare il pallottolone del DNA genomico, o estrarre per purificazione del gel elettroforetico il mio gene amplificato.
Al gene amplificato, aggiungo l'enzima di restrizione per far tagliare un plasmide da me scelto, e far avvenire la ligazione tra il mio gene adesso amplificato, e il plasmide. In questo modo posso avere il mio plasmide di cui posso farne ciò che voglio.
Attenzione però ai controlli: direzione del frammento inserito nel plasmide e richiusure dei plasmide senza l'inserto.
Per la seconda è facile, basta uasre il sistema IPTG-GAL, per vedere se il mio inserto si è inserito nel polilinker così da aver impedito la sintesi di beta galattosidasi.
Per il problema di direzionalità, dipende se a te interessa il prodotto, dato che necessiti solo l'amplificazione non è necessario un controllo particolare.
Spero di esserti stato di aiuto.
Ciao,
Riky
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atreliu
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2484 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2003 : 19:27:39
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Sempre da Enzo... (perchè non ti iscrivi al Forum?Così magari non solo l'unico che ti può aiutare )
quote:
ciao riky!!
come stai??? tutto ok??
in realtà l'amplificazione che ti dicevo la facio esattamente come l'hai spiegata tu, ma tra il dire e il fare c'è di mezzo il mare...
ti volevo chiedere altre 2 cosette...
1: sai perchè con alcuni enzimi di restrizione si mette la BSA quando tagliano???
2: dalla misurazione dell'assorbanza del dna (A260) allo spettrofotometro sai la formula per risalire alla molarità??? io devo cercarla in qst gg, perchè nn sono sicuro..
se hai tempo e voglia di spaccarti la crapa su qst quesiti fammi sapere, altrimenti nn ti procc.. nn c'è prob....
te lo chiedo perchè so che t piace molto sta roba..
--enzo--
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atreliu
Amministratore
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2484 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2003 : 23:52:33
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Allora...
Per quanto riguarda la domanda 2:
Secondo la Legge di Lambert-Beer
A=abc
A:Assorbanza
a:coefficiente di estinzione della soluzione
b:cammino ottico
c:concentrazione della soluzione
"a" viene dedotto ponendo la concentrazione ed il cammino ottico ad una unità. In questo modo l'Assorbanza corrisponderà al valore di "a".
Sapendo che a 260nm si ha un Assorbimento pari a 1 con 50ug di dna a doppio filamento
c(ng/ml) = A x 50(ng/ml)
Potresti dover diluire la soluzione.. in tal caso ti bastera moltiplicare la concentrazione trovata per il fattore di diluizione.
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