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CRISTIAN
Nuovo Arrivato

92 Messaggi

Inserito il - 24 luglio 2007 : 14:00:47

Ciao sto provando a produrre delle proteine ricombinanti in batteri BL21DE3, qualcuno conosce un buffer di risospensione del pellet da consigliarmi per risospendere i batteri prima di sonicarli?
A disposizione ho la soluzione di RIPA(� troppo aggressivo??);
oppure Lysis Buffer (50 mM potassium phosphate, pH 7.8
400 mM NaCl
100 mM KCl
10% glycerol
0.5% Triton X-100
10 mM imidazole);
oppure PBS,
Poi generalmente procedo con alcuni cicli di congelamento/scongelamento rapido, sonicazione e infine ultracentrifugo il tutto.
Grazie infinite

tommasomoro
Utente Junior

358 Messaggi

Inserito il - 24 luglio 2007 : 16:26:31

perche' non aggiungi manche un passaggio con lisozima e dnasi

cosi' vai proprio sul sicuro

magari anche una bella french press o come diavolo si chiama

e un passaggio con siringa da 0.2micron

t.

CRISTIAN
Nuovo Arrivato

92 Messaggi

Inserito il - 24 luglio 2007 : 18:30:22

ma che tampone di lisi useresti? quanta Dnasi?

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 24 luglio 2007 : 18:41:35

Io usavo questo protocollo:
- dissolvere il pellet in PBS o 10 mM Tris-Cl pH 7.5 con Protease Inhibitor
- lisi delle cellule: 2 metodi

1) digestione enzimatica
-aggiungere 1/10vol di Lisozima (10mg/ml)
- incubare in un bagnetto agitante a 37�C per 30min
- congelare in azoto liquido o nel �80�C e poi scongelare incubando a 37�C per 15 min.
- aggiungere 1/10vol di DNasi (1mg/ml) e il 10X Dnasi Buffer e agitare a 37�C per 15-30 min

2) lisi meccanica
- congelare in azoto liquido
- sonicare con burst di 15sec. (60-70%) mantenendo in ghiaccio
- aggiungere Triton X-100 ad una concentrazione finale di 1.0 %. e far girare per 30 min a 4�C.
- centrifugare a 12000 x g per 15min a 4�C
- recuperare il surnatante

Io usavo il primo metodo (digestione enzimatica) non avendo il sonicatore, l�altro non l�ho mai provato.

Aureus
Utente Junior

Prov.: Forl�-Cesena
Citt�: Gambettola

123 Messaggi

Inserito il - 24 luglio 2007 : 21:28:59

Se vuoi una miscela di lisi veloce veloce come il pinzimonio puoi provare ad usare questa:

Miscela di lisi 4X

0.2 M Tris-HCl pH 6.8
4% SDS 20%
8 mM EDTA
4% 2- Mercaptoetanolo
40% glicerolo

Puoi aggiungere anche gli inibitori delle proteasi.

Provare significa sperimentare.
Ciao

-Lorenzo-

www.tlbspazio.it

Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi

tommasomoro
Utente Junior

358 Messaggi

Inserito il - 24 luglio 2007 : 22:42:00

guarda che io stavo scherzando!!!!!!!!

che ci devi fare con le proteine espresse????

che tipo di proteine sono??

le devi purificare?? sono enzimi delicati che perdono subitol'attivita'^

sono soggette a proteolisi aspecifica etc etc etc ???

fai un po' di considerazioni e poi cerca il protocollo piu' opportuno

t.