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fedesanna
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
Città: Roma


4 Messaggi

Inserito il - 31 luglio 2007 : 19:11:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fedesanna  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di fedesanna Invia a fedesanna un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma ...buffo mi sono resa conto che quello che ho scritto non aiuta troppo a comprendere il mio problema; nel dettaglio stiamo effettuando un saggio di citotossicità con le K-562 come cells target, e le Nk cells o i PBMVs come effettori; il discorso, o meglio sarebbe il problema, è che , i nostri linfociti danno letture troppo alte come rilascio spontaneo di LDH secondo lo spettrofotometro; ne abbiamo saggiato la vitalità con il trypan blue, ed ogni volta restano vitali e non stressate; detto cio come mai valori cosi alti di ldh SE non dovrebbe esservi lisi durante l'incubazione al fine di saggiare il loro rilascio spontaneo????
Per qualsiasi domanda, anche s epreferirei aiuti...devo dire...help..

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 01 agosto 2007 : 00:21:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Premetto che non ho mai fatto saggi del genere, mi chiedo però se per caso potrebbe essere un problema di handling delle cellule? Cioè magari se le "disturbi" troppo anche meccanicamente durante l'incubazione iniziale aumentano il rilascio di LDH anche se non sono morte?
E cosa succede se invece induci citotossicità? Cioè, aggiungi qualcosa di molto tossico per le cellule (sono sicuro non sia difficile da trovare in lab!) e misura i livelli di LDH. Se sono molto più alti dei livelli che leggi spontaneamente allora comunque non c'è problema perchè riesci a distinguere un effetto citotossico dalla situazione normale.

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fedesanna
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
Città: Roma


4 Messaggi

Inserito il - 01 agosto 2007 : 20:20:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fedesanna  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di fedesanna Invia a fedesanna un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Intanto grazie, per la disponibilità!!!Non credo che sia un problema di manipolazione dei linfociti perchè abbiamo più volte provato ad indurre la loro lisi in maniera come dire cruenta, con il triton X-100 e questi valori sono nettamente molto alti rispetto ai loro valori in lettura del rilascio spontaneo, Però quello che io mi domando è se sia normale avere dopo circa 3o minuti ancora valori di 0,300 nm; considera che le cells vengono prima incubate per due ore poi centrifugate, e poi 100ul del sovranatante viene trasferito in un'altra piastra e cimentato con il mix substrato della reazione dell'LDH, ovvero NAD, Lattato,PMS e XTT; per cui secondo la letteratura non dovrebbe essere plausibile che si abbiano valori del genere in cell vitali e in buono stato di salute.e' questo il problemone.Grazie cmq fede
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