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 triplo picco alla sequenza
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cin
Utente Junior

ptero
Prov.: Padova
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Inserito il - 03 agosto 2007 : 09:02:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando


Allegato: triplo picco x forum.doc
70,63 KB

Siccome non sono riuscita ad allegare un'immagine ho provato ad allegarvi il file, spero si riesca a vedere.
Il mio quesito è il seguente: vi è mai capitato di avere in una sequenza un triplo picco?
A 380bp dell'amplificato del reverse ho trovato questo triplo picco, assolutamente assente nel forward, riconfermato peraltro con altre 3 sequenze.
Vi è mai capitato? Sapreste darmi una spiegazione? Grazie.

Biochica
Utente Junior




285 Messaggi

Inserito il - 03 agosto 2007 : 10:50:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Biochica Invia a Biochica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusa Cin ma hai usato sempre lo stesso amplificato per fare le sequenze?
A occhio la sequenza ha comunque delle schifezze fluorescenti sotto e se hai usato sempre lo stesso amplificato ti porti dietro sempre lo schifo...(oggi mi sento proprio scientifica)
Ah...non ho capito una cosa ma il forward arriva a sequenziare anche questa porzione...

Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit-
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cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
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558 Messaggi

Inserito il - 06 agosto 2007 : 13:27:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No, ho fatto un amplificato diverso. Ed anche su quello si vede il triplo picco.
Sì, il forward arriva a sequenziare quella porzione e non si vede il triplo picco.
Ciao e grazie
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Biochica
Utente Junior




285 Messaggi

Inserito il - 07 agosto 2007 : 09:14:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Biochica Invia a Biochica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Cin...non ti ho abbandonata...ieri recuperavo i postumi di un we di lavoro con 120 prelievi effettuati e ho passato la giornata a preparare alcuni campioni da spedire...e la mia mente non era sufficientemente lucida...non che oggi vada meglio ma ci provo...
Dunque...triplo picco...come ti dicevo la sequenza non è pulitissima a mio parere quindi c'è di sicuro qualche trascinamento...con cosa purifichi la reazione di sequenza?
Potrebbe anche essere un artefatto della premix che usi (quale usi?)...qualche volta capita...ma se con l'altro primer riesci a leggere almeno 10 basi a destra e 10 a sinistra del picco potresti tenere buona quella sequenza...
aspetto notizie!!!!

Io non sono cattiva...è che mi disegnano così...
-Jessica Rabbit-
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cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
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558 Messaggi

Inserito il - 08 agosto 2007 : 13:53:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Cosa intendi per premix? La mix della PCR o quella della sequenza?
Per la prima uso la TAQ della Qiagen,mentre per la seconda il Big Dye Terminator della Applied B.
Purifico l'amplificato sia da PCR che da PCR di sequenza con le colonnine Microcon- Montage della Millipore.
Certo che tengo buona la sequenza F, e anch'io penso che sia un'artefatto, ma dovuto a cosa, e perchè? Mi pare una cosa talmente strana!
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Biochica
Utente Junior




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Inserito il - 08 agosto 2007 : 17:14:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Biochica Invia a Biochica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
con premix intendevo proprio il Big Dye Terminator...usiamo esattamente la stessa cosa...
i miei colleghi per la diagnostica usano la taq platinum dell'invitrogen, ma io uso la biotools che quanto ad aspecifici tira su il mondo per cui dubito che il problema sia la taq con cui amplifichi...
Noi purifichiamo con le colonnine g50 della general electric (Ex amersham) mentre le millipore che citi non le conosco...comunque dopo una consulenza con le mie colleghe siamo convinte che quei due picchi bassi non siano altro che trascinamenti dovuti all'amplificazione di un templato non pulitissimo...oppure è colpa delle colonnine che non hanno fatto il loro dovere...

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Biochica
Utente Junior




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Inserito il - 08 agosto 2007 : 17:24:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Biochica Invia a Biochica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il mio guru delle sequenze mi ha appena detto che lei ha visto una cosa del genere sulle seq di un gene che aveva pure il suo bellissimo pseudogene per cui un picco corrispondeva a uno e il doppio picco all'altro che venivano contemporaneamente amplificati durante la pcr senza che fosse possibile distinguerli...ma dice che se tu in forward vedi un picco e in reverse il triplo picco non può essere il tuo caso...anche lei è più dell'idea che la sequenza sia sporca...

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Biochica
Utente Junior




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Inserito il - 13 agosto 2007 : 11:19:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Biochica Invia a Biochica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Cin una domanda...ma che tipo di dna stai sequenziando?

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cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
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Inserito il - 13 agosto 2007 : 14:35:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusa se non ti ho più risposto, ma dire che sono presa con le "bombe" è un'eufemismo.
E' DNA umano, in particolare sequenziamo il gene ALMS 1. Alcune mutazioni su questo gene determinano la sindrome di Alström.
Grazie per le tue risposte, mi sa che siamo rimaste le uniche qui dentro....
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Biochica
Utente Junior




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Inserito il - 13 agosto 2007 : 14:40:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Biochica Invia a Biochica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Stavo notando anch'io che siamo rimasti in pochi in questi giorni...
te lo chiedevo perchè se era un plasmide la sequenza aveva sicuramente dei problemi...i plasmidi per definizione non hanno eterozigosi!
Per casohai verificato se esistono pseudogenidi alms1?

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cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
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Inserito il - 17 agosto 2007 : 13:52:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
C'è un modo specifico per fare ciò?
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Biochica
Utente Junior




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Inserito il - 20 agosto 2007 : 10:26:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Biochica Invia a Biochica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
credo abbia trovato su ucsc le informazioni

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 20 agosto 2007 : 19:07:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
A parte il fatto che sono "quasi" tornata dalle vacanze... nel senso che la testa è ancora al mare, a quanto mi posso ricordare in questo momento anche a me sono capitate sequenze tipo la tua.
Anche in campioni diversi succedeva che ci fossero nello stesso punto picchi multipli dovuti ad uno sporco evidenziati su uno strand ma non sul complementare. Però si vede chiaramente che i due picchi di T e G sono decisamente più bassi rispetto ad A, se poi nel forward non vedi niente sei sicura che si tratti di "sporco".

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cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


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Inserito il - 21 agosto 2007 : 10:05:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In effetti il mio guru delle sequenze mi ha subito detto che si trattava di sporco e che io posso ripetere quella sequenza quante volte voglio che mi verrà sempre così, perchè è dovuto ad una circostanza di fluorofori che in quel punto si legano in quella maniera....non so se sono riuscita a spiegarmi bene
Per esserne sicura mi chiedevo se era capitato anche ad altri.
Grazie, mi conforta sapere che le cose più strane non capitano solo a me!
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cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 21 agosto 2007 : 12:36:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
credo abbia trovato su ucsc le informazioni

Cos'è? Si trova in internet?
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