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chick80
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Città: Edinburgh
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 Inserito il - 10 marzo 2005 : 21:15:03
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Il sequenziamento chimico (o metodo di Maxam e Gilbert) è il primo metodo di sequenziamento del DNA che sia stato inventato (e oramai non più usato).
Essenzialmente si marca il DNA da sequenziare (solo uno strand) ad un'estremità (5' se ricordo bene).
A questo punto si divide il DNA in 4 aliquote che si trattano con:
1) dimetilsolfato 2) acido formico 3) idrazina e 4) idrazina + NaCl.
Questi reagenti vanno a formare degli addotti specificamente con alcune basi : in particolare 1 con G, 2 con G e A, 3 con T e C e 4 con C.
A questo punto si aggiunge in tutti piperidina che permette di tagliare il DNA nel punto in cui si è formato l'addotto.
Poichè gli addotti non si formano su tutte le basi (es. il dimetilsolfato non si legherà con tutte le G, ma con qualche G e cmq in punti diversi sulle varie sequenze di DNA che tu hai nella provetta), il taglio con piperidina ti darà dei frammenti di diversa lunghezza, tutti accomunati dalla base finale (G per la prima reazione, G o A per la seconda, T o C x la terza e C per la quarta).
A questo punto carichi i 4 campioni su gel di poliacrilammide e fai un'autoradiografia: avendo marcato il 5' non vedi gli altri eventuali frammenti, ma solo quelli che iniziano dall'estremità 5' della tua sequenza e puoi quindi "leggere" la sequenza semplicemente scorrendo verticalmente il gel: se vedi una banda nella prima lane ci sarà una G, ma se la banda è presente, alla stessa altezza, anche nella seconda lane sarà una A e così via...
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