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Isabellaaaa
Nuovo Arrivato
Città: Salerno
13 Messaggi |
 Inserito il - 11 settembre 2007 : 13:31:42
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Ciao a tutti, riscontro un problema quando uso il MOPS 10x per l'elettroforesi dell'RNA,
è come se l'etidio bromuro andasse inversamente rispetto al colorante
quindi non riesco ad avere nessun riscontro fotografico, o meglio, vedo l'etidio ma dalla parte opposta!!!
che succede? pensavo fosse un problema di pH del MOPS ma niente..
L'RNA è stato estratto col kit RNAqueos - 4PCR.....HELP ME!!
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 11 settembre 2007 : 16:50:12
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Ciao
Se per "inversamente rispetto al colorante" intendi che migra dalla parte opposta all'RNA è normale che l'EtBr, essendo carico positivamente, vada verso il polo negativo. Spero che sia questo quello che volevi sapere |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 12 settembre 2007 : 09:04:17
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Non ho ben capito il problema, ma come dice RM è normale che ciò avvenga, tantè che noi per ovviare a questo inconveniente, oltre a mettere l'etidio nel gel prima di colarlo in vaschetta, ne aggiungiamo un pò al tampone di corsa e non abbiamo più avuto problemi.
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Isabellaaaa
Nuovo Arrivato
Città: Salerno
13 Messaggi |
Inserito il - 12 settembre 2007 : 12:47:08
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| Si era questo che volevo sapere vi ringrazio tantissimo!! Corro a vedere se funge, vi farò sapere.. Grazie grazie grazie |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 16 settembre 2007 : 16:43:20
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io in genere metto l'etidio direttamente nel loading buffer dell'RNA secondo il protocollo Sambrook et al.
Niente etidio nel lettino o nel buffer... il contrasto è molto più forte e si vede benissimo l'RNA sul gel scuro.
Ovvio che dal pozzetto esce una macchietta di etidio che migra in direzione opposta all'RNA, ma esce quasi subito dal gel.
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2007 : 13:47:17
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Potresti dirci le quantità esatte per il tuo metodo di colorazione con l' etidio?
Grazie
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2007 : 20:27:58
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Citazione:
Messaggio inserito da cin
Potresti dirci le quantità esatte per il tuo metodo di colorazione con l' etidio?
Grazie
L'etidio bromuro per il loading buffer di RNA lo metto (50 millig / ml)
per 5 ml di Loading buffer per RNA
Formamide 4,0 ml (80%)
Xilene 5,0 ul (0,1%)
Bromofenolo Blu 5,0 mg (0,1%)
EDTA (0,5 M pH 8-9) 20,0 ul (2 mM)
Etidio Bromuro 250 mg oppure 5 ul di una soluzione acquosa all'1% (50 mg/ml)
H2O sterile 1,0 ml
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2007 : 14:47:15
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| Grazie mille! |
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valefarfa
Nuovo Arrivato
Prov.: Teramo
Città: Teramo
24 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2007 : 23:45:57
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io ho risolto il problema in un modo drastico... niente mops, niente formaldeide o formamide.. anche io uso il kit RNAaqueous 4PCR e ho avuto gli stessi tuoi problemi...
sono uscito pazzo ed alla fine ho deciso di utilizzare TAE!.. loading buffer fornito dalla casa ed un microlitro di EtBr 1mg/ml per volumi da 10 a 30 ul, denaturazione a 65 °C per 5 minuti, in ghiaccio per altri 5 minuti e poi carico... uno spettacolo, alla faccia del mops! ciaociao |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2007 : 23:55:53
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Citazione:
Messaggio inserito da valefarfa
io ho risolto il problema in un modo drastico... niente mops, niente formaldeide o formamide.. anche io uso il kit RNAaqueous 4PCR e ho avuto gli stessi tuoi problemi...
sono uscito pazzo ed alla fine ho deciso di utilizzare TAE!.. loading buffer fornito dalla casa ed un microlitro di EtBr 1mg/ml per volumi da 10 a 30 ul, denaturazione a 65 °C per 5 minuti, in ghiaccio per altri 5 minuti e poi carico... uno spettacolo, alla faccia del mops! ciaociao
2 possono essere le cose...
o non seguivi un buon protocollo
oppure le tue sostanze non sono tanto buone (MOPS, formaldeide etc)
in TAE il pH non è favorevole all'RNA... si degrada dopo un po' anche mentre migra
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Discussione |
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elettroforesi RNA
Didattica
