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LUCIA14976
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
 Inserito il - 14 settembre 2007 : 11:04:03
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Ciao a tutti,
sto facendo un'estrazione di RNA da tessuto adiposo, con fenol-cloroformio. Dopo la prima precipitazione non ho trovato le solite tre fasi, o meglio ci sono tre fasi, ma il sopranatante che è la fase che in genere tengo sembra il sottonatante. forse per il tessuto adiposo questo è normale e sarei tentata di prendere il sottonatante, se qualcuno avesse esperienza a proposito e mi potesse dare una conferma o smentita lo apprezerei molto
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 16 settembre 2007 : 16:22:40
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Non so se ho capito bene...
1) che tipo di estrazione usi? GTC, trizol o altro?
2) in che senso credi che il surnatante sembra il sottonatante? come te ne accorgi? dal colore?
3) è possibile che si tratti del colorante che si trovi nella fase sbagliata?
nella mia esperienza è capitato più volte di vedere "cose strane" durante l'estrazione di DNA o RNA.
Specie se il tessuto che analizzo è un po' più ricco di lipidi, ad esempio estrazione da Cervello vs fegato, ma non ho mai visto il tessuto adiposo dove la quantità di RNA rispetto al peso totale sarà 1% rispetto ad altri tessuti.
In genere in questi casi correggo la quantità di cloroformio rispetto al fenolo poiché il cloroformio essendo lipofilo, ed in genere presente in quantità inferiore rispetto al fenolo, potrebbe essere sequestrato dai lipidi e quindi potrebbe non essercene abbastanza per separare bene le fasi.
In questi casi parte del fenolo resta nella fase acquosa e si porta anche il colorante.
Quindi quando vedo qualcosa di strano aggiungo altro cloroformio fino ad un rapporto 1:1 con il fenolo ed ovviamente uso anche l'alchool isamilico (1:49 rispetto al cloroformio). Agito e centrifugo di nuovo.. in genere funziona, ma se puoi dopo ripeti l'estrazione perché quando ci sono troppi lipidi potresti portarti qualche schifezza appresso e non accorgertene.
in bocca al lupo
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