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mareiko
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3 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2007 : 11:59:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mareiko Invia a mareiko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
salve qualcuno può spiegarmi, con parole semplici,(già ci hanno provato i miei colleghi ma niente nnn c'è verso)che cosè la linearità e come si fa? cioè mettere a confronto l'espressione d 2 geni, un housekeeping per eempio e uno del quale vuoi conoscere l'espressività. (almeno così ho capito). gerazie anticipatamente.

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2007 : 12:19:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Puoi spiegarci meglio la situazione? Sinceramente non ho mai sentito parlare di linearità nel confronto dell'espressione di due geni...
L'idea è che l'housekeeping è un gene che viene espresso ad un livello stabile (e generalmente alto) nelle tue cellule.
Quindi se hai 2 gruppi di cellule (o tessuti) che derivano da 2 situazioni diverse (es. trattato con un farmaco o meno etc) puoi misurare il livello di housekeeping e del tuo gene di interesse in entrambi i gruppi. Siccome l'housekeeping è stabile puoi vedere se l'altro è cambiato riferendolo all'housekeeping.

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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 16 settembre 2007 : 18:19:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Complicato da rispondere in 2 parole.
In effetti c'è una grossa variazione di quantitativo di RNA totale che estrai ogni volta ed è difficile che con delle semplici misure allo spettrofotometro tu riesca ad avere sempre la stessa quantità ad ogni campione ottenuto.

In pratica se tu amplificassi un gene X da RNA estratti anche dal medesimo tessuto, troveresti sicuramente una grossa variabilità nel prodotto di PCR. Ovvero per quanto puoi lavorare perfettamente trovi sempre che un campione può dare più amplificato perché ha semplicemente più RNA o si è retrotrascritto meglio in cDNA. Quasi sempre è un impercettibile errore nel pipettamento, basta 1/10 di microlitro (es puntale sporco della soluzione di cDNA) per ottenere grosse differenze.

Per questo motivo è necessario paragonare l'espressione del tuo gene X ad un gene Y (housekeeping) la cui espressione non varia nella tua procedura sperimentale...
...ad esempio l'actina è housekeeping e non varia nei trattamenti con o senza aspirina. Quindi puoi dire che l'actina rappresenta l'1% dell'RNA totale... se prendi più RNA totale troverai più actina e viceversa.

Quindi se paragoni la PCR del gene X al gene Y con la formula CTRL=X/Y Trattato=X/Y puoi sapere se il gene X durante il trattamento è aumentato o si è ridotto rispetto all'RNA totale delle cellule che stai considerando, indipendentemente dal fatto che hai messo un po' più o meno di RNA durante la retrotrascrizione.

Tuttavia c'è da dire che c'è un problema noto da un sacco di tempo, quello della linearità per l'appunto.
Ovvero la PCR consente un'amplificazione esponenziale ed ha un punto di saturazione in prossimità del quale l'amplificazione si riduce ad ogni ciclo fino a diventare 0 ovvero saturo.
Per capirlo dovremmo disegnarlo insieme su di un grafico.
In pratica se metti su di un grafico y=quantità di prodotto di PCR, e X=numero di cicli.
All'inizio dei cicli il prodotto è insignificante, poi aumenta di molto in modo esponenziale, poi si ferma per il fenomeno della saturazione, sul grafico somiglia ad una S.

Prima di iniziare a quantizzare tu devi essere sicuro di trovarti nelle condizioni sperimentali di linearità, ovvero nell'amplificazione esponenziale, altrimenti non sei in grado di capire se il tuo gene aumenta o si riduce. Nel punto di saturazione infatti tutte le bande sono più o meno identiche.

Se ti trovassi prima della linearità (basso numero di cicli) non vedi niente perché l'amplificato è troppo poco per essere visibile, se ti trovassi dopo la linearità (alto numero di cicli) praticamente tutto è saturo quindi le bande appaiono di una intensità quasi identica e non relazionata a quanto cDNA hai messo nel tubo di PCR.

Nella fase esponenziale (linearità), invece, il logaritmo della quantità di banda che ottieni è relazionata alla quantità di cDNA da cui sei partito (per questo si dice lineare). Solo in questa zona puoi effettivamente tenere fede ai dati che hai ottenuto dopo la PCR.
Per farlo devi
1) standardizzare il tuo protocollo di estrazione e retrotrascrizione (prendo x microgrammi di RNA per la retrotrascrizione e prendo y microlitri di cDNA per l'amplificazione)
2) se intendi usare y microlitri di cDNA da analizzare negli esperimenti allora prendi una quantità y-1 microlitri di cDNA, y microlitri di cDNA, e y+1 microlitri di cDNA e li amplifichi... se trovi che c'è una proprozionalità tra i tre campioni, es 1-2-3 microlitri danno bande di intensità 1-2-3 allora sei in grado di vedere se il tuo gene aumenta o diminuisce in quelle condizioni.
Se questo avviene allora per tutti gli esperimenti utilizzerai sempre x microgrammi di RNA e y microlitri di cDNA con Ct numeri di cicli di PCR, poiché sai che in quelle condizioni ti trovi nella linarità
3) nel caso che 1-2-3 microlitri diano la stessa identica banda allora sei a saturazione, non sei in grado di vedere differenze tra i campioni, devi diminuire il numero di cicli della PCR per trovare il giusto equilibrio, oppure diminuire la quantità y di cDNA che usi per la PCR
4) nel caso che 1-2 microlitri non danno niente e 3 microlitri incomincia a dare un po' di amplificato significa che il numero di cicli è troppo basso e non hai amplificato abbastanza per vederlo su gel.

Insomma è come se tu dovessi valutare con una telecamera a biano e nero se un colore grigio è più chiaro o più scuro di un altro... per farlo non puoi aprire il diaframma al massimo altrimenti tutto appare bianco (saturo di luce), e non puoi chiudere del tutto il diaframma altrimenti non vedi niente (tutto buio). Il giusto equilibrio di cicli invece ti fa vedere le differenze di intensità (zona lineare)

questo è il motivo per cui la comunità scientifica preferisce utilizzare la Real-Time PCR, poiché è in grado di fare un grafico mentre fa l'amplificazione dei tuoi campioni... senza fare tante analisi preliminari, tu puoi vedere il grafico e scegliere di considerare l'amplificato al punto migliore di linearità evitando le zone di saturazione. Questo è possibile addirittura campione per campione, quindi puoi evitare di quantificare precisamente ogni volta i campioni di RNA o di cDNA... poiché puoi correggere questi dettagli dopo o durante il processo di PCR.

miii come sono stato luuuungo


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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 17 settembre 2007 : 01:21:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ah ok, ora capisco cosa si intende per linearità! Esaurientissima risposta!

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