metodica BRET

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silele
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3 Messaggi

Inserito il - 17 settembre 2007 : 18:28:57

ciao a tutti,
sono elena,
volevo sapere se qualcuno poteva illustrarmi la metodica BRET
grazie

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 18 settembre 2007 : 00:56:37

Ciao Elena.

BRET = bioluminescence resonance energy transfer.

E' una variante della FRET (fluorescence resonance energy transfer) che funziona pressapoco nello stesso modo e ti permette di studiare se due proteine interagiscono, o perlomeno se sono vicine.

Il lavoro originale in cui viene descritta � questo:

A bioluminescence resonance energy transfer (BRET) system: Application to interacting circadian clock proteins

In pratica tu vuoi studiare le proteine A e B.
Crei due proteine di fusione A-luciferasi e B-GFP.
In presenza di un opportuno substrato (es. coelentarazina) la luciferasi produce luce attorno a 480 nm. Se la proteina A � vicino (10-100 amstrong) alla proteina B, allora questa luce emessa pu� eccitare la GFP che emette poi a circa 530 nm.

Quindi se vedi emissione a 530 nm vuol dire che A e B sono vicine e probabilmente stanno interagendo.
Se invece non vedi luce a 530 nm allora non hai interazione.

La FRET funziona esattamente nello stesso modo, ma invece di avere la luciferasi hai un'altro fluoroforo.
Quindi devi eccitare ad una certa lunghezza d'onda il fluoroforo 1 che poi emette a una seconda lunghezza d'onda la quale � in grado di eccitare il fluoroforo 2 che emette ad una terza lunghezza d'onda che tu vai a misurare.

Il vantaggio della BRET rispetto alla FRET � che la luciferasi non � colpita da photobleaching e che non devi eccitare le cellule con una luce fluorescente che pu� portare a diversi problemi di rumore di fondo e fototossicit�.

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silele
Nuovo Arrivato

3 Messaggi

Inserito il - 18 settembre 2007 : 10:45:06

grazie mille chick80, sei stato molto gentile ed esaustivo,

legger� l'articolo che mi hai consigliato