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Nica
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Città: Firenze
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
 Inserito il - 18 settembre 2007 : 17:49:00
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Ciao
1 Devo dire che non capisco il tuo dubbio: come fai a dire che hai contaminazione da DNA semplicemente leggendo al nanodrop?
2 per me è necessaria una standard curve per ogni gene. Se l'efficienza dei primers è comparabile con quella dell'housekeeping ed è elevata uso poi sempre le stesse condizioni e diluizioni di cDNA ma non la aggiungo ogni volta; rifaccio però la curva ogni volta che ho una nuova sintesi di cDNA o un nuovo batch di primers.
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Nica
Nuovo Arrivato
Città: Firenze
14 Messaggi |
Inserito il - 19 settembre 2007 : 17:06:22
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Ciao RM,
grazie per le tue risposte; allora della contaminazione di DNA me l'ha detto l'ufficio tecnico della Qiagen e mi ha detto che il range della lettura a 260 nm ottimale è 0,1-1 altrimenti " c'è troppo DNA che interferisce con la valutazione dell'RNA"..insomma cosa faccio se ho un campione che ha un 260/280 a 2 e 260 a 3? la concentrazione che mi dà lo spettrofotometro è ancora corretta? dove ho sbagliato nell'estrazione?
grazie |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 19 settembre 2007 : 18:21:58
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Citazione:
Messaggio inserito da Nica
Ciao RM,
grazie per le tue risposte; allora della contaminazione di DNA me l'ha detto l'ufficio tecnico della Qiagen e mi ha detto che il range della lettura a 260 nm ottimale è 0,1-1 altrimenti " c'è troppo DNA che interferisce con la valutazione dell'RNA"..insomma cosa faccio se ho un campione che ha un 260/280 a 2 e 260 a 3? la concentrazione che mi dà lo spettrofotometro è ancora corretta? dove ho sbagliato nell'estrazione?
grazie
uhmm... che io sappia la lettura 260/280 e 260 serviva per vedere la contaminazione del DNA o RNA da parte delle proteine...
La capacità di distinguere il DNA dall'RNA al nanodrop mi sorge nuova dato che entrambi hanno praticamente lo stesso spettro di assorbimento. Se hai dubbi leggiti il Maniatis o Sambrook, c'è una sezione apposita per la verifica della purezza del DNA o RNA da proteine con queste lunghezze d'onda.
Per il resto non ho mai usato un kit per l'estrazine di RNA, quindi meglio contattare direttamente l'assistenza tecnica della ditta da cui hai comprato il kit per capire cosa puoi fare.
P.S.: attenta alle DNasi, ne esistono diverse... è ovvio che devi prendere quella RNasi Free!
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RM
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 19 settembre 2007 : 20:06:15
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Per quanto no so io, il range della lettura ottimale deve essere tra 0.1 e 1 perchè al disopra o al di sotto non è più valida (o almeno non perfettamente accurata)la proporzionalità tra O.D e concentrazione (in pratica la lambert-beer). La risposta della Qiagen onestamente mi giunge davvero nuova...dal momento che il loro kit si chiama RNA (non DNA) extraction kit e che hai trattato con DNAsi non vedo perchè parlino di DNA che interferisce con la valutazione dell'RNA. Il rapporto 260/280 uguale a 2 è ottimo; per quanto riguarda la A260= 3 (che dovrebbe corrispondere a circa 120 ng/uL) se ti preoccupa diluisci semplicemente il campione 1:3 (circa 40 ng/uL)(cioè OD=1) o 1:4 e rileggilo.
Ciao |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2007 : 14:29:06
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| Hai controllato che il nanodrop non abbia problemi? Noi avevamo dei valori di rapporto non ottimale e la cosa non era tanto giustificabile, visto che il kit di estrazione era sempre lo stesso; poi ha incominciato a dare messaggi tipo che c'era una bolla d'aria, alla fine l'abbiamo spedito in ditta ed era starato. |
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Nica
Nuovo Arrivato
Città: Firenze
14 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2007 : 15:48:34
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OK ragazzi grazie a tutti per le risposte. Effettivamente la risposta della ditta era un po' confusa;
E' come avete detto voi: se il campione è troppo concentrato (A 260>1) per la legge di Lambert Beer la proporzionalità viene a mancare e quindi la lettura non è più corretta, è quindi necessario fare una diluizione.
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Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 16 maggio 2012 : 15:43:37
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| io invece vorrei chiedere se qualcuno sa come ottenere un ratio 260/230 attorno a valori ottimali (2) per RNA. ho esatrtto da lisato di midollo osseo con kit quiagen ma il rapporto 260/230 è bassissimo. come posso fare per migliorarlo?? |
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purezza RNA e PCR
Didattica
