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atreliu
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2970fired
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2484 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2003 : 15:30:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di atreliu  Invia a atreliu un messaggio AOL  Invia a atreliu un messaggio ICQ  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di atreliu  Invia a atreliu un messaggio Yahoo! Invia a atreliu un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il vettore pET è in un sistema che prevede due parti: nel genoma ed il vettore..
Nel genoma:
è presente il promotore Lac seguito dalla polimerasi T7.

Il vettore:

Questo vettore contiene un marker (verde), il gene LacI (blu), il promotore di trascrizione T7, l'operatore Lac (verde petrolio) in 3' al promotore T7, e un polylinker (nero), in cui verrà inserito il frammento/gene da amplificare.

Si è scelto una polimerasi fagica per due motivi:
-l'attività del promotore T7 sul vettore, dipende dall'espressione sul genoma della polimerasi fagica T7 (e quindi dalla sua espressione regolata da Lac).
-la forte processività, e quindi espressione del gene da amplificare.

Controllo regolazione:
L'inserimento di IPTG o un altro analogo del lattosio prevede che questo si leghi al repressore presente a livello del promotore Lac, permettendo quindi la trascrizione ed espressione della polimerasi T7.
Una volta prodotta la polimerasi, questa va subito a permettere l'espressione del gene inserito sul vettore.

Si pensi che in poche ore, il componente principale della cellula risulta essere il prodotto del gene inserito.
In realtà una velocità così alta può causare problemi di folding nelle proteine complesse. Per ovviare a questo problema si possono attuare condizioni diverse (diminuizione temperatura di crescita, etc), o cercare un sistema di regolazione/inibizione di Lac, o puntare verso un sistema di espressione più tradizionale (scelta di un promotore meno processivo).

Sperando che possa essere utile..

Riky
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