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 Tecnica ELISA: analisi antigene-anticorpo
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atreliu
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Inserito il - 07 ottobre 2003 : 16:08:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di atreliu  Invia a atreliu un messaggio AOL  Invia a atreliu un messaggio ICQ  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di atreliu  Invia a atreliu un messaggio Yahoo! Invia a atreliu un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Rilevamento del complesso antigene-anticorpo mediante enzyme-linked immunoassay (ELISA)
Metodo usato in diagnostica e per studiare interazioni antigene-anticorpo.

Procedura:
1. Adsorbimento dell'antigene sul fondo di una vaschetta di reazione (provetta, piastra petri, pozzetto di una piastra per ELISA): verso la soluzione contenete l'antigene nella vaschetta di reazione in condizioni in cui l'antigene si adsorbirà ; rimozione dell'antigene in eccesso; saturazione dei siti liberi sulla superficie (in genere di materiale plastico) della vaschetta di reazione con prteina non reattiva (albumina di siero bovino o latte scremato) per impedire l'adsorbimento dell'anticorpo alla superficie della vaschetta.
2. Un'aliquota di una soluzione contenente l'anticorpo viene aggiunta alla vaschetta di reazione. Dopo incubazione per permettere la formazione dell'eventuale complesso antigene-anticorpo (giallo), la soluzione che contiene l'anticorpo libero viene rimossa.
3. Incubazione con anticorpo secondario per la rivelazione del complesso antigene-anticorpo primario: trasferimento nella vaschetta di reazione di una soluzione contenente un anticorpo specifico per il frammento costante dell'anticorpo primario. Allontanamento dell'anticorpo secondario in eccesso. L'anticorpo secondario formerà un complesso con l'anticorpo promario a sua volta associato all'antigene (specifico). L'anticorpo secondario è modificato e porta legato un enzima (tipicamente perossidasi o fosfatasi alcalina).
4. Rilevazione del complesso antigene-anticorpo: aggiunta del substrato dell'enzima coniugato all'anticorpo secondario: si sceglie un substrato sintetico tale per cui il prodotto della reazione con l'enzima coniugato all'anticorpo secondario è colorato ( tipicamente: giallo per lamfosfatasi alcalina o rosso per laperossidasi): la presenza del complesso antigene-anticorpo primario viene rilevata attraverso lo sviluppo del colore. L'intensità del colore dipenderà (a parità di tempo di incubazione) dal numero di complessi presenti.

Utilizzo del metodo per determinare proprietà dell'antigene o dell'anticorpo:
- Determinazione della costante di dissociazione del complesso: formazione del complesso antigene-anticorpo primario in presenza di concentrazioni crescenti di antigene libero;
- Selezione di anticorpi (o antigeni) a affinità diversa: formazione del complesso antigene-anticorpo primario in condizioni di stringenza diversa o dopo pretrattamenti con denaturanti

Risultati di un test ELISA: l'assenza del colore giallo indica l'assenza del complesso antigene-anticorpo primario nel campione analizzato; l'intensità del colore giallo nei diversi pozzetti della piastra ELISA è proporzionale al numero di complessi antigene-anticorpo (primario) formati e quindi alla concentrazione dell'antigene(in grado di legare l'anticorpo primario) nel campione analizzato.
Sono possibili schemi sperimentali diversi in cui in ogni reazione parallela si immobilizza lo stesso campione di antigene e si utilizzano campioni di anticorpi (primari) diversi . In questo caso lo sviluppo del colore e la sua intensità saranno misure della presenza di anticorpi primari in grado di riconoscere l'antigene e della loro concentrazione (o affinità per l'antigene).


Riky
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