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coccinellas
Utente Junior

Citt�: l'isola che non c'�

138 Messaggi

Inserito il - 03 ottobre 2007 : 13:39:32

Salve,
ho bisogno del vostro aiuto! Come faccio a capire se le bande comparse sul mio gel nativo sono isoforme dello stesso enzima?

Biochica
Utente Junior

285 Messaggi

Inserito il - 03 ottobre 2007 : 15:01:47

Ho fatto un lavoro del genere in tesi, per verificare che in un liofilizzato commerciale della proteina con cui lavoravo aveva qualche contaminante con la stessa capacit� enzimatica...nel mio caso era stato abbastanza semplice e devo dire anche carino (� stata una delle foto pi� belle della mia tesi)...la proteina con cui lavoravo ossidava l'L-Dopa per cui abbiamo preparato una soluzione del substrato e l'abbiamo messa sul gel alla fine della corsa al posto dei tradizionali coloranti, le uniche bande che abbiamo visto erano presenti solo al peso molecolare della nostra proteina...
Che tipo di attivit� enzimatica ha la proteina con cui lavori? La cosa pi� semplice � quella di individuare il substrato e "colorare" come ho fatto io...
Ma il campione caricato sul nativo che tipo di campione �?un purificato?un lisato?

Io non sono cattiva...� che mi disegnano cos�...
-Jessica Rabbit-

coccinellas
Utente Junior

Citt�: l'isola che non c'�

138 Messaggi

Inserito il - 03 ottobre 2007 : 16:56:21

.............il campione caricato su gel nativo non � un purificato ma un lisato. In effetti ho provato ad utilizzare una colorazione che ne evidenziasse l'attivit�, ed il risultato � stato la rivelazione di 3 bande, tuttavia abastanza distanti tra loro. Ora considerando che si tratta (forse) di isoforme , le bande non dovrebbero apparire quasi addossate? che ne pensi?
Grazie dell'aiuto!

Biochica
Utente Junior

285 Messaggi

Inserito il - 03 ottobre 2007 : 17:30:56

Non necessariamente le bande devono essere addossate, dipende dall'isoforma...io blotto una proteina con 5 isoforme di glicosilazione pi� la forma non glicosilata e le bande non sono addossate...oltre al fatto che dipende dalla percentuale del gel in cui hai corso i campioni!Se il gel ha una percentuale bassa magari le bande si sono separare meglio rispetto ad un gel con pi� alta percentuale di arilamide...
Hai caricato i controlli?

Io non sono cattiva...� che mi disegnano cos�...
-Jessica Rabbit-

coccinellas
Utente Junior

Citt�: l'isola che non c'�

138 Messaggi

Inserito il - 03 ottobre 2007 : 18:43:48

............nel gel nativo le molecole corrono in base alla carica, quindi il fatto che le bande delle isoforme siano distanti tra loro significa che hanno carica diversa? Da cosa dipende?

Biochica
Utente Junior

285 Messaggi

Inserito il - 04 ottobre 2007 : 12:08:59

sono note le isoforme della tua proteina?

Io non sono cattiva...� che mi disegnano cos�...
-Jessica Rabbit-

coccinellas
Utente Junior

Citt�: l'isola che non c'�

138 Messaggi

Inserito il - 04 ottobre 2007 : 12:40:33

....si sono note tre isoforme!

Biochica
Utente Junior

285 Messaggi

Inserito il - 04 ottobre 2007 : 13:45:11

controlli non ne hai?
ci sono altre proteine che convertono lo stesso substrato?

ti tempesto di domande perch� l'unica spiegazione che trovo sta nella corsa...cerco di escludere contaminazioni...ma se vedi solo le tre bande nel gel possono essere solo le isoforme della proteina...

le isoforme da cosa derivano? cio�...sono date da tre isoforme dello stesso gene o il gene � identico ma la proteina ha diversi livelli di glicosilazione o altre modificazioni?
vedi la proteina con cui lavoro io ha semplicemente cinque isoforme di glicosilazione...

Io non sono cattiva...� che mi disegnano cos�...
-Jessica Rabbit-

coccinellas
Utente Junior

Citt�: l'isola che non c'�

138 Messaggi

Inserito il - 04 ottobre 2007 : 22:33:47

.........ho trovato un p� di materiale in letteratura che mi ha dato conferma del fatto che le tre bande presenti sul mio gel sono le tre isoforme, ma ringrazio anche te Biochica per il valido aiuto e la pazienza mostrata!
Grazie+

tommasomoro
Utente Junior

358 Messaggi

Inserito il - 05 ottobre 2007 : 09:49:08

mass spect

http://www.cs.utexas.edu/users/smriti/ch391l/project/final_project/node2.html

http://www.mcponline.org/cgi/content/full/3/1/1

T.

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