Forum

Nome Utente:
Password:
Riconoscimi automaticamente
 Tutti i Forum
 Laboratorio
 Biologia Molecolare
 conservazione dell'RNA
 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
I seguenti utenti stanno leggendo questo Forum Qui c'è:

Aggiungi Tag Aggiungi i tag

Quanto è utile/interessante questa discussione:

Autore Discussione  

Nica
Nuovo Arrivato

Città: Firenze


14 Messaggi

Inserito il - 17 ottobre 2007 : 15:57:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Nica Invia a Nica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Qualcuno ha idea di quanto tempo l'RNA di un pellet di cellule possa conservarsi a -80 °C?
E quello già estratto?
Meglio fare l'RT al più presto e di tutto? Dalle mie parti viene fatto di volta in volta l'RT a seconda di quante sonde vogliono vedere..

darkene
Utente Junior

occhi



291 Messaggi

Inserito il - 18 ottobre 2007 : 00:21:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di darkene Invia a darkene un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io l'ho tenuto anche qualche mese senza avere problemi. certo l'RNA è meno stabile del cDNA, ma l'importante è misurarne la concentrazione ogni volta che lo usi.
Torna all'inizio della Pagina

Cangrande
Utente Junior

Cangrande Della Scala

Prov.: Verona


280 Messaggi

Inserito il - 18 ottobre 2007 : 13:43:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Cangrande Invia a Cangrande un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Concordo dopo un mese! Personalmente preferisco stoccare il cDNA (fobie personali). Dipende moltissimo da quanto viene aperto-chiuso il freezer a -80

Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala.
Torna all'inizio della Pagina

byo_gio
Nuovo Arrivato

0211_da_bettina

Prov.: MI
Città: Milano


66 Messaggi

Inserito il - 18 ottobre 2007 : 19:55:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di byo_gio Invia a byo_gio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
da quel che ne so io l'RNA gia' estratto va conservato in 1/10 di sodio acetato 3M pH 5.2 e 2,5 volumi di etanolo al 95% a -20°C...
Torna all'inizio della Pagina

Nica
Nuovo Arrivato

Città: Firenze


14 Messaggi

Inserito il - 18 ottobre 2007 : 20:35:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Nica Invia a Nica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
..figuriamoci io lo conservo in H2O RNasi free!non lo sapevo.
quindi se ho dei campioni "vecchiotti" nel -80 C non ci trovo + o quasi RNA? che ansia allora è tutto un fare RT e PCR e di corsa!
Torna all'inizio della Pagina

darkene
Utente Junior

occhi



291 Messaggi

Inserito il - 18 ottobre 2007 : 23:23:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di darkene Invia a darkene un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
non è detto. dipende anche da quanto abbondante è l'rna di tuo interesse. certo, se stai studiando geni espressi a bassi livelli...il consiglio è retrotrascriverli.
Torna all'inizio della Pagina

Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 19 ottobre 2007 : 17:49:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da byo_gio

da quel che ne so io l'RNA gia' estratto va conservato in 1/10 di sodio acetato 3M pH 5.2 e 2,5 volumi di etanolo al 95% a -20°C...



questo è un pessimo modo di conservazione.
Di fatti lo stato di precipitazione in alcool che procuri in questo modo fa in modo che nessun enzima o ione possa internferire con la stabilità del tuo RNA, quindi la degradazione è praticamente assente.
Tuttavia tutto questo è a scapito del grado di recuperabilità dell'RNA dopo la precipitazione.
In altre parole è meglio non far stare troppo tempo il DNA e RNA precipitato in alcool poiché si disidratano sempre di più fino ad essere irrecuperabili o inutilizzabili pur essendo integri.
Una volta disidratato il DNA o l'RNA oltre un certo livello è difficilissimo rispospenderlo senza portarsi dietro l'alcol (corrente di azoto fino a secco poi 4°C o.n. sotto lenta agitazione in TE) ed in questa fase l'RNA si può degradare.

Il metodo migliore è usare acqua milliro con un po' di DEPC degasato (0,1%) e tris-base con pH leggermente acido (ultrafiltrata) conservato in fondo ad un -80°C con un siberino vicino per evitare gli sbalzi termici ogni volta che si apre il freezer.
Se l'RNA è purificato bene può stare lì per anni senza degradarsi (anche se si trova solo a -20°C).

Se l'RNA si porta appresso anche ioni o proteine varie è tutto inutile comunque.

Torna all'inizio della Pagina

Nica
Nuovo Arrivato

Città: Firenze


14 Messaggi

Inserito il - 19 ottobre 2007 : 22:01:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Nica Invia a Nica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
wow grazie di tutte queste informazioni!
altre domanducce:
Prima di estrarre l'RNA noi conserviamo le cellule come pellet nel -80 , anche così si possono conservare, per quanto?
Una volta estratto posso scongerlarlo + di una volta per fare diversi RT, senza provocarne una degradazione?
Torna all'inizio della Pagina

Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 20 ottobre 2007 : 00:27:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Nica

wow grazie di tutte queste informazioni!
altre domanducce:
Prima di estrarre l'RNA noi conserviamo le cellule come pellet nel -80 , anche così si possono conservare, per quanto?
Una volta estratto posso scongerlarlo + di una volta per fare diversi RT, senza provocarne una degradazione?



Per quanto riguarda le cellule a -80°C non saprei, non l'ho mai fatto, ma considerando che per i tessuti tutto sommato va bene anche per settimane... credo che nel tuo caso si può conservare almeno per lo stesso tempo se non di più, ma non saprei dirti per quanto. Nelle cellule l'RNA è in continuo contatto con proteine e ioni che lo degradano, ed anche se sei a -80°C qualche processo funziona ancora, persino l'autodegradazione spontanea dell'RNA... Però sto solo speculando, non saprei proprio.

Per quando riguarda i cicli di congelamento e scongelamento in pratica non è mai una buona idea. Gli oligonucleotidi non durano mai più di 5-6 cicli di congelamento e scongelamento poi si degradano.
Non so a quanti cicli possa resistere un RNA estratto, ma di sicuro non più di 4-5, e devi riquantizzare ogni volta che scongeli, verificando lo stato di degradazione.

In vita mia non ho mai congelato RNA per più di una notte, l'ho sempre retrotrascritto tutto o quasi poco dopo l'estrazione, ovviamente solo se si tratta di un'ottima estrazione e poi le divido in aliquote che congelo.

Il tuo meccanismo di retrotrascrizione ogni tanto mi risulta un po' difficile da capire

Torna all'inizio della Pagina

cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 25 ottobre 2007 : 15:14:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Molto spesso si mitizza questo RNA come se fosse una delicatissima bolla di sapone che basta un niente per vederla trasformarsi in aria...
Noi conserviamo anche per diversi mesi i pellet delle cellule sempre a -80, certo prima si possono processare meglio è.
L'RNA è in H2O RNAse,DNAse free ottenuta mediante una cartuccia della millipore che si collega al MILLIQ che si chiama Pirograd. Conserviamo l'RNA a -80 anche per anni. Considera che io faccio le corse per vedere la qualità dell'RNA con il Bioanalyzer dell'Agilent sempre con lo stesso controllo + che è RNA di tessuto adiposo (rognosissimo)o cellule di adipociti, ormai da 3 anni, ed i campioni sono sempre sovrapponibili e di buona qualità.
Invece è il cDNA che si degrada più facilmente, non so se a causa dell'RT o del fatto che viene conservato a -20, ma una cosa certa al 100% è che più è diluito e per meno tempo sarà stabile. Di questo ce ne siamo accorti con le diluizioni degli standard e dei campioni per le real.
Torna all'inizio della Pagina

Nica
Nuovo Arrivato

Città: Firenze


14 Messaggi

Inserito il - 25 ottobre 2007 : 17:14:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Nica Invia a Nica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie ciò mi consola!
Torna all'inizio della Pagina

nomis
Nuovo Arrivato

0613_da_Fil23

Città: roma


16 Messaggi

Inserito il - 25 ottobre 2007 : 19:15:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di nomis Invia a nomis un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
sono d'accordo con cin!!!
nelle mie mani l'RNA ben concentrato a -80.... si conserva bene per anni. per quanto riguarda le cellule io screpo direttamente la piastra in TRIZOL (no so tu con che reagente lo estrai) e lo conservo a -80 quando mi serve estraggo l'RNA(anche dopo 1 anno). ci sono in commercio delle eppendorf specifiche per lutilizza di acidi nucleici o proteine. ho fatto una verifica e permettono di perdere molto meno materiale... ma è una sciccheria!!!!
Torna all'inizio della Pagina

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 26 ottobre 2007 : 02:25:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da cin


Invece è il cDNA che si degrada più facilmente, non so se a causa dell'RT o del fatto che viene conservato a -20, ....




Cin meno male che lo dici anche tu... mi consola!!! Anch'io uso per mesi e a volte anni gli stessi RNA e funzionano benissimo... mentre il cDNA mi si degrada e dopo poco non funziona più... pensavo di essere "anormale" io! Tutti dicono il contrario!!!
Comunque io ultimamente tengo sia cDNA che RNA a -30°C, ma per un motivo pratico... nel -80°C ci mettono le mani tutti... e spostano anche le cose altrui... mentre il -30°C è MIO!!! E il mio RNA sta bello tranquillo ed è meno soggetto a sbalzi termici!
Torna all'inizio della Pagina

cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 26 ottobre 2007 : 09:14:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Eh sì GFPina, lo sbalzo termico..... dire fondamentale è dire poco! Una volta congelate siano esse cellule o RNA non le tiriamo più fuori fino al momento del processamento.
Come al solito si cerca di fare tutto nel più breve tempo possibile, nel senso che solitamente se so di estrarre, poi retrotrascrivo subito( a meno che non ci siano imprevisti). Le ragazze che fanno colture cellulari mettono nel pellet il buffer di lisi e condervazione per l'RNA:RLT della QIAGEN. Poi mettono a -80 e lì resta anche per un anno fino a che non si decide di estrarne l'RNA. Noi estraiamo con le colonnine della Qiagen, quantifichiamo,ne vediamo la qualità, trattiamo con DNAse della Ambion,retrorascriviamo. Il cDNA concentrato lo teniamo a -20, mentre diluiamo i campioni il meno possibile in modo da gettare dopo l'utilizzo le aliquote diluite.
Per nomis:
non ho capito cosa sono le eppendorf specifiche che fanno cosa?
Torna all'inizio della Pagina
  Discussione  

Quanto è utile/interessante questa discussione:

 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
Vai a:
MolecularLab.it © 2003-18 MolecularLab.it Torna all'inizio della Pagina