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stefy83
Nuovo Arrivato


Prov.: Milano
Città: Milano


4 Messaggi

Inserito il - 20 ottobre 2007 : 13:04:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di stefy83 Invia a stefy83 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, mi chiamo stefania e studio biologia. Mi chiedevo: è possibile aggiungere ad un lisato cellulare una fosfatasi per defosforilare una proteina prima di correrla su gel SDS-page??[/size=2][/size=3]

Luca-DNA
Nuovo Arrivato

Prov.: Torino
Città: Torino


68 Messaggi

Inserito il - 20 ottobre 2007 : 13:20:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Luca-DNA  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Luca-DNA Invia a Luca-DNA un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sinceramente non so proprio...ma penso che per vedere una proteina defosforilata basta non aggiungere al tampone di lisi gli inibitori delle fosfatasi (es. PMSF) in modo da non bloccare le fosfatasi endogene presenti nel lisato...

A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin)
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 20 ottobre 2007 : 16:34:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Pienamente d'accordo, purchè esista una chinasi endogena in quantità sufficiente,
ATP in quantità sufficiente, e una specificità sufficiente da parte della suddetta
chinasi. Tutte queste cose sono limitanti.

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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stefy83
Nuovo Arrivato


Prov.: Milano
Città: Milano


4 Messaggi

Inserito il - 20 ottobre 2007 : 19:22:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di stefy83 Invia a stefy83 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie...
Quindi non è possibile che la doppia banda che il mio anticorpo riconosce sul mio western blot sia l'isoforma fosforilata della mia proteina?
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Luca-DNA
Nuovo Arrivato

Prov.: Torino
Città: Torino


68 Messaggi

Inserito il - 20 ottobre 2007 : 20:12:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Luca-DNA  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Luca-DNA Invia a Luca-DNA un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh...potrebbe anche essere (dipende sempre dalla presenza o meno di inibitori delle fosfatasi)...oppure potrebbe essere una modificazione post-traduzionale della proteina in questione...alcune proteine corrono come doppietti in lisati totali...

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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 20 ottobre 2007 : 23:17:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La cosa più veloce per risolvere quel dubbio sarebbe provare con un anticorpo specifico per la forma fosforilata.

Nel caso di un doppietto io andrei prima a pensare a possibili aggregati della proteina. Che proteina è e che peso hanno le due bande?

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stefy83
Nuovo Arrivato


Prov.: Milano
Città: Milano


4 Messaggi

Inserito il - 21 ottobre 2007 : 10:47:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di stefy83 Invia a stefy83 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Purtroppo non ho un anticorpo per la forma fosforilata, e in realtà non credo che esista, nessuno ha mai ipotizzato che questa proteina possa essere fosforilata, per cui dovrei togliermi questa "curiosità" con i mezzi che ho! E' una proteina di membrana e a mio avviso le due bande sono troppo vicine per essere degli aggregati (mi aspetterei che un aggregato avesse almeno un peso molecoare doppio rispetto al monomero...)

Citazione:
Messaggio inserito da chick80

La cosa più veloce per risolvere quel dubbio sarebbe provare con un anticorpo specifico per la forma fosforilata.

Nel caso di un doppietto io andrei prima a pensare a possibili aggregati della proteina. Che proteina è e che peso hanno le due bande?

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Luca-DNA
Nuovo Arrivato

Prov.: Torino
Città: Torino


68 Messaggi

Inserito il - 21 ottobre 2007 : 13:57:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Luca-DNA  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Luca-DNA Invia a Luca-DNA un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non può essere un precursore? Oppure una forma modificata della tua proteina (magari mantenuta nel reticolo endoplasmatico e non ancora portata in membrana)...ancora non potrebbe essere ubiquitinata???
Sono solo ipotesi...

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Luca-DNA
Nuovo Arrivato

Prov.: Torino
Città: Torino


68 Messaggi

Inserito il - 21 ottobre 2007 : 14:05:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Luca-DNA  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Luca-DNA Invia a Luca-DNA un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Comunque se ti vuoi togliere la curiosità di andare a vedere se la tua proteina è fosforilata...puoi immunoprecipitare la tua proteina in estratto totale e fare un WB utilizzando un anticorpo, ad esempio, anti fosfo-Tyr (se può essere fosforilato in Tyr)...
Nello stesso modo, decorando poi la membrana con l'anticorpo specifico per la tua proteina riesci a vedere se hai IP entrambe le bande...nel caso tu abbia IP solo una banda...beh, probabilmente l'altra banda è aspecifica...

Ciao

Luca

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stefy83
Nuovo Arrivato


Prov.: Milano
Città: Milano


4 Messaggi

Inserito il - 21 ottobre 2007 : 14:12:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di stefy83 Invia a stefy83 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
si, potrebbe essere ognuna di queste cose...
Magari proverò un anticorpo antifosfotirosina.
Grazie.
ciao

Citazione:
Messaggio inserito da Luca-DNA

Comunque se ti vuoi togliere la curiosità di andare a vedere se la tua proteina è fosforilata...puoi immunoprecipitare la tua proteina in estratto totale e fare un WB utilizzando un anticorpo, ad esempio, anti fosfo-Tyr (se può essere fosforilato in Tyr)...
Nello stesso modo, decorando poi la membrana con l'anticorpo specifico per la tua proteina riesci a vedere se hai IP entrambe le bande...nel caso tu abbia IP solo una banda...beh, probabilmente l'altra banda è aspecifica...

Ciao

Luca

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