| Autore |
Discussione |
|
|
lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
 Inserito il - 24 ottobre 2007 : 22:24:04
|
CIAO!!!!!!!!! ho delle domande da porvi.sembreranno banali e stupide ma vorrei alcune spiegazioni se possibile...scusate se le elenco ma così almeno sono più facili da leggere..
1)se ho una aliquota di matrigel da 100 ul la devo diluire 1:1000 in terreno cioè porto a volume di 10 ml ma nn ho capito..
2)se devo mettere una tot quantita di matrigel ad es 50 ul per cm^2 e so ke la six well ha superficiè di 10 cm^2 allora avrò 50*10=500 ul nella well. Ma se il protocollo mi dice ad es 5 ug /cm^2 e la superficie della well ad es è 10 cm^2 appunto ke calcolo devo fare?
3)EBBS corrisponde all'HEPES per caso? perchè io ho soluzione di HEPES-BSS
4)175 g cm faccio a sapere a quanti rmp di centrifuga corrispondono? esiste una tabella x caso?
5)adesso la domanda più complicata: si consiglia x le cellule nasali essendo sensibili di mettere 0.025% trispina+ 0.01% edta quindi tot 0.035%. Io ho soluzione trispina edta indicata così: tripsina 0.025% edta 0.01%, poi c'è scritto 0.25 mg/ml V= 100 ml. La mia domanda è questa su 4 ml di terreno quanta ne metto? devo fare direttamente 0.035%*4=0.0014 ke corrisponde a 1.4 ul di cui porto a v finale i 4 ml di terreno?
GRAZIE a chiunque mi chiarisca queste doamnde!! Elisa
|
|
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2007 : 03:53:02
|
Allora, una alla volta...
Citazione:
1)se ho una aliquota di matrigel da 100 ul la devo diluire 1:1000 in terreno cioè porto a volume di 10 ml ma nn ho capito..
Ah... queste diluizioni! Il meccanismo è sempre lo stesso!
Diluire 1:1000 vuol dire mettere 1 parte ogni 1000 parti totali. Quindi se hai 1 ul lo devi portare a volume fino a 1000 ul (=1ml), se hai 1 ml lo devi mettere in 1 litro, se hai 36.4 ul li devi mettere in 36.4 ml e così via.
Se hai 100 ul li devi mettere in 100 * 1000 = 100000 ul = 100 ml (non 10)
Se dovessi diluire chessò, 1:350 dovresti mettere 1 parte ogni 350
Quindi un'aliquota da 10ul in quel caso andrebbe in 10*350=3500ul (=3.5ml) di soluzione totale.
Ti consiglio di farti un po' di esercizi del genere perchè questi sono concetti di base da sapere se vuoi lavorare in un laboratorio. Sono cose che devi fare tutti i giorni e, benchè noi non abbiamo problemi a spiegartele, è molto meglio per te capirle per essere sicura di quello che stai facendo.
Citazione:
2)se devo mettere una tot quantita di matrigel ad es 50 ul per cm^2 e so ke la six well ha superficiè di 10 cm^2 allora avrò 50*10=500 ul nella well. Ma se il protocollo mi dice ad es 5 ug /cm^2 e la superficie della well ad es è 10 cm^2 appunto ke calcolo devo fare?
Devi fare 5ug/cm^2*10cm^2 e trovi 10ug. Il protocollo dovrebbe specificare in che volume dissolverlo.
Citazione:
3)EBBS corrisponde all'HEPES per caso? perchè io ho soluzione di HEPES-BSS
L'HEPES è un tampone organico: http://en.wikipedia.org/wiki/HEPES
L'EBSS è una soluzione con la seguente composizione:
KCl, NaHCO3, NaCl, NaH2PO4 e glucosio
L'HEPES-BSS non la conosco, potrebbe essere come l'EBSS ma con HEPES invece del bicarbonato.
Teoricamente potrebbero essere intercambiabili, ma l'unica è provare.
Citazione:
4)175 g cm faccio a sapere a quanti rmp di centrifuga corrispondono? esiste una tabella x caso?
Di solito le centrifughe possono essere settate sia in rpm (rotation per minute) sia in rcf (relative centrifugal force), ossia i g.
Ad ogni modo puoi convertire tra le due qui:
http://www.labcare.co.uk/RCF.html (ti serve il raggio del rotore)
Citazione:
5)adesso la domanda più complicata: si consiglia x le cellule nasali essendo sensibili di mettere 0.025% trispina+ 0.01% edta quindi tot 0.035%. Io ho soluzione trispina edta indicata così: tripsina 0.025% edta 0.01%, poi c'è scritto 0.25 mg/ml V= 100 ml. La mia domanda è questa su 4 ml di terreno quanta ne metto? devo fare direttamente 0.035%*4=0.0014 ke corrisponde a 1.4 ul di cui porto a v finale i 4 ml di terreno?
Ma non se ne era già parlato? Comunque se nel terreno devi avere 0.025% di tripsina non puoi partire da una soluzione che è già allo 0.025%. Devi partire da una soluzione più concentrata e diluirla nel tuo terreno. Ad es. parti da una soluzione al 2.5% e la diluisci 1:100 (1 parte per ogni 100 parti). |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
 |
|
|
lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2007 : 08:48:43
|
quindi uso una soluzione di tripsina edta allo 0.5% concentrata e ne prelevo lo 0.035% (in quanto considero 0.025% tripsina e 0.01% di edta) quindi (so ke ogni volta stufo mauna volta capito poi vado alla grande  ) quindi se il terreno è 4 ml il calcolo sarà: 0.035*470.5=0.oo28 cioè 2.8 ul però se in calcolatrice metto questi calcoli senza dividere per cento lo 0.035% il risultato è 0.28 quindo 280 ul ecco qui in questi calcoli cm devo comportarmi? grazie |
|
|
|
lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2007 : 08:52:29
|
| per quanto riguarda la prima domanda hai ragione infatti anke a me sembrava sbagliato ma mi hanno detto di mettere 10 ml e nn capivo il calcolo x quello ti ho kiesto anke perchè risp cn arroganza se si kiede qualcosa in più cosa posso farci. Quindi su 100 mlmetto 100 ul di matrigel ma per portare a volume tolgo 100 ul di terreno...poi prelevo 1 ml di tutto e lo metto nella well però mi sembra troppo diluito il matrigel o sbaglio? e gli altri ml li posso usare nelle altre well? se no butto via 100 ml di terreno...e poi il gg dopo nn potrei più usarlo il matrigel diluito così mi hanno detto |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2007 : 09:22:49
|
Citazione:
quindi uso una soluzione di tripsina edta allo 0.5% concentrata e ne prelevo lo 0.035% (in quanto considero 0.025% tripsina e 0.01% di edta) quindi (so ke ogni volta stufo mauna volta capito poi vado alla grande ) quindi se il terreno è 4 ml il calcolo sarà: 0.035*470.5=0.oo28 cioè 2.8 ul però se in calcolatrice metto questi calcoli senza dividere per cento lo 0.035% il risultato è 0.28 quindo 280 ul ecco qui in questi calcoli cm devo comportarmi? grazie
C'è un errore di fondo: non ha senso sommare le percentuali in quanto sono due composti diversi e le % sono riferite al volume totale.
La tua soluzione stock contiene una certa % di tripsina ed una certa % di EDTA. Il rapporto fra queste due percentuali non potrà mai cambiare. Nel momento che aggiungi un po' di questa soluzione al tuo terreno stai aggiungendo tripsina e EDTA, non sono separabili.
Quindi, a meno di non aggiungere separatamente una soluzione di tripsina (senza EDTA) e una di EDTA, il tuo stock dovrà avere delle % dei due componenti multiple di quella che devi avere alla fine.
Se quindi tu devi avere 0.025% di tripsina e 0.01% EDTA puoi usare uno stock con 2.5% di tripsina e 1% EDTA, oppure 5% tripsina e 2% EDTA oppure 10% tripsina e 4% EDTA etc etc etc.
Tuttavia, non potrai mai ottenere quelle percentuali se parti da uno stock ad es. con 2.5% di tripsina e 3% EDTA in quanto dovresti diluirlo in modo diverso per ottenere la giusta concentrazione di uno o dell'altro componente.
Citazione:
Quindi su 100 ml metto 100 ul di matrigel ma per portare a volume tolgo 100 ul di terreno
Anche se in teoria hai ragione, per diluizioni così alte non c'è bisogno che togli 100 ul dai 100 ml perchè tanto la frazione è così piccola che non fa differenza avere 99.9 o 100 ml.
Citazione:
poi prelevo 1 ml di tutto e lo metto nella well però mi sembra troppo diluito il matrigel o sbaglio?
Se lo stock che hai va usato 1:1000 evidentemente va bene così... probabilmente lo stock è molto concentrato.
Citazione:
poi prelevo 1 ml di tutto e lo metto nella well però mi sembra troppo diluito il matrigel o sbaglio? e gli altri ml li posso usare nelle altre well? se no butto via 100 ml di terreno
Chiaro che lo puoi usare nelle altre wells! Visto che non lo puoi riusare il giorno dopo conviene preparare solo quanto te ne serve. Per esempio, se hai 24 wells e metti 1 ml per well prepara 30 ml (conviene sempre abbondare un po' per evitare di rimanere senza). |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2007 : 10:06:22
|
| ma allora cosa faccio0.025%*4ml/0.5%=0.2 ne metto 200 ul giusto di tripsina |
|
|
|
lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2007 : 11:01:20
|
spero ke la risp della tripsina sopra citata sia giusta così ho capito le diluizioni...ma se ho ad es. 3.30 mg/ml di sostanza 1 e la devo portare a diluizione 0.60 mg/ml con 50 ml di acqua e 50 ul di sostanza 2 ke faccio qui la diluizione n riesco a farla |
|
|
|
lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2007 : 17:33:27
|
2)se devo mettere una tot quantita di matrigel ad es 50 ul per cm^2 e so ke la six well ha superficiè di 10 cm^2 allora avrò 50*10=500 ul nella well. Ma se il protocollo mi dice ad es 5 ug /cm^2 e la superficie della well ad es è 10 cm^2 appunto ke calcolo devo fare?
Devi fare 5ug/cm^2*10cm^2 e trovi 10ug. Il protocollo dovrebbe specificare in che volume dissolverlo.
ma allora faccio 10 ug* 1 ml di terreno presente nella well e quanto metto? |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 26 ottobre 2007 : 04:00:39
|
Citazione:
se ho ad es. 3.30 mg/ml di sostanza 1 e la devo portare a diluizione 0.60 mg/ml con 50 ml di acqua e 50 ul di sostanza 2 ke faccio qui la diluizione n riesco a farla
Non importa se hai già un'altra sostanza, l'importante è il volume finale.
Se hai una sostanza a 3.30 mg/ml e la vuoi portare a 0.60 mg/ml allora la devi diluire 3.30/0.60 = 5.5 volte. Quindi se vuoi 50 ml di soluzione finale dovrai metterci 9.09ml (=50/5.5) della tua sostanza e 41 di solvente.
Citazione:
ma allora faccio 10 ug* 1 ml di terreno presente nella well e quanto metto?
Dipende dal tuo stock. Fatti una soluzione 1mg/ml e ce la diluisci 1:100 (0.99ml terreno + 10 ul di stock) |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 26 ottobre 2007 : 10:00:15
|
2)se devo mettere una tot quantita di matrigel ad es 50 ul per cm^2 e so ke la six well ha superficiè di 10 cm^2 allora avrò 50*10=500 ul nella well. Ma se il protocollo mi dice ad es 5 ug /cm^2 e la superficie della well ad es è 10 cm^2 appunto ke calcolo devo fare?
Devi fare 5ug/cm^2*10cm^2 e trovi 10ug. Il protocollo dovrebbe specificare in che volume dissolverlo.
ma allora faccio 10 ug* 1 ml di terreno presente nella well e quanto metto? |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
|
|
lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 29 ottobre 2007 : 09:46:30
|
ma nn ho capito |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 29 ottobre 2007 : 10:04:39
|
| Se devi mettere 10 ug in 1 ml metti 10 ug in 1 ml.... non capisco quale sia il tuo problema. Ovviamente non pesi 10 ug, ma fai una soluzione più concentrata che diluisci. |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 29 ottobre 2007 : 10:53:33
|
| ma cm faccio a fare una soluzione più concentrata ke diluisco? |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 29 ottobre 2007 : 11:15:14
|
Scusami ma non capisco proprio dove sia il problema...
Per fare una soluzione più concentrata basta diluire una quantità più alta di matrigel.
Es. visto che a te serve una concentrazione finale di 10 ug/ml puoi fare una soluzione 1 mg/ml (100X) dissolvendo 1 mg di matrigel in 1 ml di terreno.
Poi la diluisci 1:100 nel tuo terreno (cioè metti 10ul di stock e 990 di terreno). |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
lisetta
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: mialno
91 Messaggi |
Inserito il - 29 ottobre 2007 : 12:11:29
|
| si adesso ho capito...però se devo mettere 10 ug /cm^2 e la mia piastra è di 10 cm^2 posso fare 10 x 10 quindi metto 100 ul in 1 ml nella well giusto? |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
|
| |
Discussione |
|
dubbi su cellule e diluizioni
Relazioni
