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deidrogenasi
Nuovo Arrivato

Prov.: Cosenza
Città: oriolo

8 Messaggi

Inserito il - 30 ottobre 2007 : 22:10:27

salve signori,mi è successo di preparare degli anticorpi primari in milk con latte invece di tween...e non sono riuscito a vedere niente..secondo voi l' acqua all'interno del milk cosa ha fatto alle proteine presenti su una membrana di pvdf????
grazie..ciao

ciccio

Iside
Utente Attivo

Città: Napoli

1375 Messaggi

Inserito il - 30 ottobre 2007 : 23:22:19

Citazione:
Messaggio inserito da deidrogenasi

anticorpi primari in milk con latte invece di tween

non ho capito

!
normalmente tu in cosa diluisci il primario? il milk o la bsa vengono comunemente usati per questo.

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...

deidrogenasi
Nuovo Arrivato

Prov.: Cosenza
Città: oriolo

8 Messaggi

Inserito il - 01 novembre 2007 : 00:50:03

Ciao Iside,
li c è un errore volevo die che ho preparato il milk per l'anticorpo in acqua invece di utilizzare il tween...non sono riuscito a vedere piu una proteina...non capisco cosa è successo alla mia membrana di pvdf che conteneva le proteine...

ciccio

Iside
Utente Attivo

Città: Napoli

1375 Messaggi

Inserito il - 01 novembre 2007 : 12:11:14

premetto che non ho esperienza con membrane pvdf, ma hai pensato a stripparla e a incubarla di nuovo? se il problema è nel milk (ma non penso) così dovresti vedere la proteina.

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...

deidrogenasi
Nuovo Arrivato

Prov.: Cosenza
Città: oriolo

8 Messaggi

Inserito il - 01 novembre 2007 : 16:25:04

purtroppo ho pravato a fare anche quello ma non mi è rimasta una sola proteina sulla membrana...non riesco a capire perche tutto questo!!!forse la variazione del pH ha modificato la ionizzazione delle mie proteine variando i legami idrofobici della membrana..
l' unica spiegazione che posso darmi...

ciccio

Iside
Utente Attivo

Città: Napoli

1375 Messaggi

Inserito il - 01 novembre 2007 : 16:53:27

Citazione:
Messaggio inserito da deidrogenasi

purtroppo ho pravato a fare anche quello ma non mi è rimasta una sola proteina sulla membrana

hai colorato con il ponceau?

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...

deidrogenasi
Nuovo Arrivato

Prov.: Cosenza
Città: oriolo

8 Messaggi

Inserito il - 01 novembre 2007 : 16:55:34

si ho colorato con il rosso ponceau...e ho rilevato solo poche proteine

ciccio

chick80
Moderatore

Città: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 01 novembre 2007 : 21:48:27

Non è che semplicemente è andato male il trasferimento per qualche motivo?
Ad ogni modo se non hai proteine l'unica è rifare il western.... non c'è altra soluzione

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Neuroscience
Utente

659 Messaggi

Inserito il - 02 novembre 2007 : 01:18:44

Anche a me capitò una volta di fare il latte in acqua, l'anticorpo andò a male per il pH (credo). L'esperimento non mi è uscito perché il filtro è uscito scuro.
Tuttavia le proteine erano ancora lì. Però bisogna dire che dopo il blot non puoi fare il rosso ponceau... se il filtro è blottato il filtro sarà carico di rosso in modo più o meno omogeneo.
In conclusione...
1) Può essere che erano già poche prima
2) Puoi averle perse durante i lavaggi che hai fatto dopo
3) Può essere che tu abbia fatto il blot, lavato male e fatto il ponceau... quindi hai visto le proteine del latte insieme alle proteine dei tuoi estratti.

meglio che rifai il western,
io ricordo di non essere riuscito a recuperare il filtro, nel dubbio lo gettai.

là
Utente Junior

565 Messaggi

Inserito il - 03 novembre 2007 : 14:37:57

già che siamo in tema di western: secondo voi è meglio preparare l'anticorpo primario nel latte oppure in TBS o in tween?

Iside
Utente Attivo

Città: Napoli

1375 Messaggi

Inserito il - 03 novembre 2007 : 17:42:07

mah. ho sentito varie cose in proposito. c'è chi dice che c'è differenza e chi incuba le membrane sempre allo stesso modo. io in generale preferisco incubare con milk/TBST quando cerco forme fosforilate della mia proteina e con BSA/TBST in tutti gli altri casi. faccio in questo modo perchè quando cominciai a fare i western mi dissero che la bsa poteva interferire con le fosfoproteine, ma in verità mi è capitato di non avere milk e lavorare solo in bsa e le lastre sono uscite comunque bene.

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...

deidrogenasi
Nuovo Arrivato

Prov.: Cosenza
Città: oriolo

8 Messaggi

Inserito il - 03 novembre 2007 : 18:52:25

io di solito uso milk in TBST perche lavoro su proteine fosforilate come P-BAD o P-AKT....ma di solito utlizzo il milk anche per proteine non fosforilate e lo sviluppo viene bene...naturalmente preferisco il milk perche costa meno...

ciccio

Eleo
Nuovo Arrivato

Prov.: Pavia

89 Messaggi

Inserito il - 03 novembre 2007 : 21:06:49

io per tutti i miei w.b. ho usato TBS tween e latte e anche TBS e latte (senza tween) e mi sono sempre venuti dei bei western!!! se sapevo in anteprima che l'anticorpo dava background facevo più lavaggi e più frequenti!

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