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scorza
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: palermo
30 Messaggi |
 Inserito il - 13 novembre 2007 : 10:09:58
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salve,spero che possiate aiutormi;
tra qualche giorno ho un esame di genetica molecolare e ho dei dubbi sulla tecnica aso dotblot.
potreste aiutarmi??come funziona??
ciao
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
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scorza
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: palermo
30 Messaggi |
Inserito il - 13 novembre 2007 : 10:46:05
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quindi non si fa la pcr?
io credo di aver letto che prima si faceva la pcr e poi l'ibridazione su membrana con sonde....è possibile???
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 13 novembre 2007 : 11:34:19
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| credo che si faccia su DNA cromosomico. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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scorza
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: palermo
30 Messaggi |
Inserito il - 13 novembre 2007 : 11:49:20
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| a me interessava saperlo per la diagnosi della fibrosi cistica |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 13 novembre 2007 : 14:08:26
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No si fa su amplificato!
Si amplifica mediante PCR uno o più frammenti del gene che si vuole studiare.
Si legano i prodotti di PCR ad un filtro di nitrocellulosa e si fanno ibridare con sonde ASO (Allele Specific Oligonucleotide), in genere una coppia per ogni mutazione che si vuole analizzare, una che si lega al wt e una al mutato!
Le sonde sono marcate radioattivamente oppure biotinilate, dopo l'ibridazione e gli oppurtuni lavaggi solo le sonde complementari rimangono attaccate al filtro e dopo rivelazione è possibile visualizzare sulla membrana degli "spot" dove DNA e sonda si sono legati e quindi identificare le mutazioni.
Questo è il dot-blot, esiste anche il reverse dot-blot in cui fai il contrario, leghi alla membrana le sonde! In questo caso è il prodotto di PCR però ad essere marcato! |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 13 novembre 2007 : 14:17:48
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hai ragione GFPina! si fa su amplificato!
comunque, scorza, quì c'è un bell'articolo sull'uso delle tecniche nella diagnosi molecolare di FC tra cui l'ASO dot-blot
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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scorza
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: palermo
30 Messaggi |
Inserito il - 13 novembre 2007 : 14:20:19
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| grazie tante!!! |
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scorza
Nuovo Arrivato
Prov.: Palermo
Città: palermo
30 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2007 : 11:20:31
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scusate....ma c'è differenza con la tecnica ARMS?
sembrano molto simili...
ciao |
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Talia
Nuovo Arrivato
.jpg)
Prov.: Napoli
Città: Napoli
35 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2008 : 23:07:38
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Ma quindi sia nell'ASO che nel REVERSE DOT BLOT utilizzo 2 tipi di sonda durante l'esperimento?Sia quella per l'allele mutato che quella per l'allele wild type?
Se è così...come faccio,nel momento in cui c'è ibridazione a capire se ha ibridato la sonda per l'allele mutato o quella per l'allele wild type? |
Talietta |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 01 luglio 2008 : 18:57:52
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Citazione:
Messaggio inserito da Talia
Se è così...come faccio,nel momento in cui c'è ibridazione a capire se ha ibridato la sonda per l'allele mutato o quella per l'allele wild type?
Beh ovviamente devi utilizzare due membrane! 
Una la fai ibridare con la sonda wt e una con la sonda mut.
Se hai un reverse dot blot sai dove sono legate le sonde e quindi puoi analizzare più sonde contemporaneamente, ma ovviamente un singolo campione alla volta.
Comunque adesso ormai si utilizzano i microarray, in questo caso le sonde (o i campioni) sono marcati con fluorofori differenti e puoi analizzarli sullo stesso supporto! |
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Talia
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Napoli
35 Messaggi |
Inserito il - 01 luglio 2008 : 19:05:02
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Ok,ti ringrazio...
Credevo che nell'ASO si potessero discriminare le due diverse sonde sulla stessa membrana magari perchè erano marcate con radioisotopi diversi!:) |
Talietta |
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aso dotblot
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